体积排阻高效液相色谱电感耦合等离子体质谱测定印度芥菜中镉的形态

　　　　作者：杨红霞 刘崴 李冰 魏巍 张惠娟 陈登云

【摘要】 建立了体积排阻高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法(SECHPLCICPMS)测定镉超积累植物印度芥菜中镉的形态分析方法。在镉胁迫下，诱导产生植物螯合肽(PCs)。因此，在叶片和根部均检测到植物螯合肽(PC)3Cd、植物螯合肽(PC)2Cd、谷胱甘肽(GSH)Cd，及半胱胺酸(Cys)Cd 4种形态。研究结果证明，植物螯合肽的合成机制为先形成GSHCd而后形成植物螯合肽。在植物不同部位，Cd存在形态不同。叶片中主要以GSHCd存在，而在根部主要以PC2Cd为主，结合不同镉刺激浓度条件下植物体内镉分布规律初步推断：根部PC2Cd除了自身合成产生外，还有部分为叶部转移。为了防止巯基化合物氧化反应的发生，样品采取液氮保护并于-70 ℃保存，样品分析全流程用氮吹防氧化措施。

【关键词】 形态分析， 镉， 体积排阻高效液相色谱， 电感耦合等离子体质谱

　　 　　 1 引 言

　　重金属Cd对植物具有一定的毒害性， 当毒害达到一定程度，植物就会表现出种种中毒症状。Cd超积累植物，如印度芥菜，体内生成一些特定功能的螯合体与有毒元素结合成稳定的化合物而消除这些元素的毒性作用，表现出较强的重金属抗性。这种螯合体即为植物螯合肽Phytochelatins(PCs)。PCs是一种富含巯基的寡肽，结构通常为(γGluCys)nGly，其中n=2～11。PCs对Cd2+的螯合能力很强，在重金属的累积和解毒过程中发挥重要作用[1～4]。通常认为，PC对重金属解毒的机理是重金属离子进入植物体后，与细胞内的PC结合形成复合物，然后转运到特定的细胞器(主要为液泡)，进行区室化固定，从而使细胞质中有毒金属离子浓度降低到植物能够忍耐的程度。然而，文献[5～7]指出，PCs在金属解毒机制中仅有短暂的作用，与超积累植物的高耐受性并不总是相关。

　　很多研究者已经注意到绝大多数调查者经常用极高的Cd浓度刺激植物，然后报道植物在过量刺激下的反应，这并不能反映环境中的真实情况[6，8]。另外，Sanit[6]指出，植物对不同浓度水平的Cd的反应非常复杂的现象，可能会有很多不同的机制同时起作用。不同水平的耐受性和动态平衡的相互转换也是一个复杂的过程，忽略这一点，在解释PCs在植物耐受Cd毒害以及在植物生长过程中的作用时可能会得出互相矛盾的结论。目前，PCs研究的重点集中在PC在细胞中的转移[1，9]，而在植物长距离传输过程中是否产生PCs研究甚少。Wei等[10]研究表明，虽然在Cd胁迫下，PCs可能参与了Cd的长距离运输，但木质部中的Cd主要靠有机酸和无机阴离子运输。因此，准确测定Cd与不同螯合体的结合形态对于解释植物体内重金属的迁移机制及解毒机制是非常必要的。

　　体积排阻色谱分离(SECHPLC)与电感耦合等离子体质谱(ICPMS)联用技术同时具有交联葡聚糖(sephadex G50)分子筛凝胶过滤层析的根据分子量分离化合物的优点和ICPMS灵敏的多元素同时检测优点，又因为其流动相一般采用中性的TrisHCl/NaCl缓冲液，与生物体本身体内条件相似，因此可以较准确地反应PC以及其它巯基化合物在生物体内的与元素结合状况[10]。本研究建立了SECHPLCICPMS测定植物体内Cd形态方法，在印度芥菜内检测到PC3Cd， PC2Cd， 谷胱甘肽(GSH)Cd，及半胱胺酸(Cys)Cd 4种形态。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　7500a型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent 公司)，工作参数：射频功率1350 W;采样深度5.7 mm;Babinton型雾化器;载气流速1.10 L/min;采样模式：时间分辨;采样时间2000 s;样品提升速率1 mL/min。1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。色谱柱：TSKGEL G3000分离柱及TSKGELTM PW guard Column保护柱，流速0.8 mL/min，进样量100 μL，自动进样。

　　EDTACd标准溶液：用10 mmol/L EDTA配制1.14 mg/L EDTACd，对Cd未知峰进行定量分析，使用时按需要逐级稀释。CysCd及GSHCd标准溶液：在氮 气保护下配制约10 μg/L CysCd及GSHCd， 用于确定色谱峰保留时间。流动相：配制10 mmol/L TrisHCl 缓冲液，其中加入0.1 mol/L NaCl和0.03% NaN3，调节pH=7.5，0.45 μm滤膜过滤，N2气鼓泡赶干净溶解氧。

　　营养液：1.25 mmol/L KNO3，1.25 mmol/L Ca(NO3)2，0.5 mmol/L MgSO4，0.25 mmol/L Kh3PO4，11.6 μmol/L H3BO3，4.5 μmol/L MnCl2·4h3O，10 μmol/L FeEDTA，0.19 μmol/L ZnSO4·7h3O，0.12 μmol/L(NH4)6Mo7O24和0.08 μmol/L CuSO4·5h3O。实验用水为去离子水再经MilliQ装置纯化(&>18 MΩ·cm)制得。

　　2.2 植物培养

　　印度芥菜种子撒在珍珠岩上，用蛭石覆盖完全。放入周转箱内，周转箱内放少量水至没过筐底，外加少量Ca(NO3)2(&<5 mmol/L)营养液。蒙上实验用纱布，放在培养箱，温度设置为28 ℃。待发育出两片子叶，取出，光照下培养。等长至子叶完全伸展开，开始补加1/4营养液。待苗茁壮，开始间苗至周转箱。周转箱内放1/4营养液，5 d后换全营养液培养。以后每3 d更换一次营养液。植株长成后，用不同浓度的Cd标准溶液进行刺激。

　　2.3 样品处理

　　取适量Cd溶液培养的鲜叶片和根系样品，在液氮中浸泡后，于干净的玛瑙研钵中研磨。加入1.00 g干净石英砂， 5.00 mL缓冲液，将样品研磨至浆状。磨碎后转移至10 mL离心管，用TrisHCl清洗研钵，一并移入离心管。4 ℃离心10 min，转速为10000 r/min，上层清液转移入干净离心管置于冰箱(-70 ℃)保存。分析前，将样品从冰柜中取出，氮气保护下解冻，0.2 μm过滤后快速上机分析。

　　3 结果与讨论

　　3.1 Cd形态分离与检测

　　在印度芥菜的叶片和根部均检测到4种未知峰，根据分子量标准试剂所做的分子量保留时间公式，计算其大致分子量，再通过半胱胺酸(Cys)Cd、谷光甘肽(GSH)Cd标准物质保留时间(图1a)及文献[11，12]报道的分子量范围初步推断13.5 min处为CysCd，10.2 min为GSHCd，8.8 min为(PC)2Cd，7.8 min为(PC)3Cd，谱图如图1b所示。

　　3.3 植物不同部位Cd形态分布规律

　　对同一株植物的叶片和根系同时进行Cd形态分析。大量数据表明，在植物的不同部位，Cd的形态分布不同。在叶片中，Cd主要以GSHCd形态存在，而在根部Cd主要以PC2Cd形态存在(图1b)。 图2 分析时间与Cd形态稳定性色谱图

　　根据不同Cd刺激浓度下叶片和根部Cd形态分布规律初步推断：根部PC2Cd除了自身合成产生外，还有部分为叶片转移。

　　3.4 Cd形态稳定性

　　在Cd的4种形态中，GSHCd不稳定，易被氧化成PCsCd。本工作在样品前处理过程中，采取了严格的防氧化措施：样品处理前用液氮浸泡，研磨过程全程液氮保护，样品处理后立刻置于冰箱(-70 ℃)保存。分析前在氮吹保护下解冻，解冻后当天快速上机分析。图2是当天解冻后立即测定与解冻后冰箱内放置一星期后样品的色谱对比图，可以看出，一星期后GSHCd减少，PC2Cd增加。证明了以上防氧化措施是非常必要的。4 结 论

　　本工作建立了SECHPLCICPMS测定印度芥菜中Cd形态分析方法，在植物叶片和根部共检测出PC3Cd、PC2-Cd、GSHCd和CysCd 4种形态，验证了植物螯合肽的合成机制，即先形成GSHCd而后形成植物螯合肽。在对植物不同部位进行分析时，发现叶片中Cd主要以GSHCd形态存在，且随着Cd刺激浓度的增加略有下降，而根部Cd主要以PC2Cd形态存在，随着Cd刺激浓度的增加而增加，可以初步推断：根部PC2Cd除了自身合成产生外，还有部分为叶部转移，从而具有很强的金属抗性。为了防止巯基化合物的氧化反应的发生，本实验全流程采取液氮及氮吹的防氧化措施。

参考文献

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