重金属镉离子人工合成抗原的荧光特性分析

【摘要】 以1(4异硫氰苄基)乙烯基二胺N，N，N′，N′四乙酸为双功能螯合剂，偶联Cd2+与血清蛋白质分子， 合成了Cd2+人工抗原。利用荧光光谱分析了Cd2+人工合成抗原的荧光特性并得到合成反应的偶联比为11∶1～16∶1；通过荧光相图分析表明， Cd2+人工抗原合成过程中血清蛋白质的折叠状态符合“二态模型”；偏振荧光光谱检测结果显示， Cd2+人工抗原合成中血清蛋白质色氨酸残基的微区构象发生一定变化，导致载体蛋白质构象改变。

【关键词】 镉， 人工抗原， 荧光分光光度法

Detection of Artifical Antigen for Cd by Ｆluorescence Spectrometry

　　GUO Ming， PANG ShuoQuan， ZHANG LuYing

　　Department of Chemistry， Zhejiang Forestry University， Lin′an 311300

　　Abstract Artificial antigen CdIEDTABSA (HSA) was successfully synthesized by the bifunctional chelating agent IEDTA (isothiocyanobenzylethyl enediamine tetraacetic acid) coupling with cadmium and protein carrier. The fluorescence characteristics of antigen were determined by fluorescence spectrophotometry and the coupling ratio 11∶1－16∶1 was obtained for the coupling reaction. The folding status of serum albumin during the synthesis process of artificial antigen CdIEDTABSA (HSA) was analyzed using “fluorescence phase diagram”， and the result shows that it was conformed to the “allornone” pattern. The polarization fluorescence spectra show that the microenvironments of tryptophan residues in carrier protein have some changes to cause changes in protein conformation.

　　Keywords Cadmium， artificial antigen， fluorescence spectrophotometry

　　1 引 言

　　持久污染物重金属镉对人类健康危害极大，镉的残留检测在环境、食品安全等领域已引起广泛关注。免疫分析检测是近年发展起来的速测新技术，已大量应用在有机污染物残留检测领域[1～3]，重金属免疫分析是研究的新方向。重金属免疫分析技术的核心为抗体的制备，而人工抗原的成功合成又是获得抗体制备的关键，故建立重金属人工合成抗原的检测、表征手段具有重要意义。目前，荧光分光光度法对重金属人工合成抗原的检测报道甚少，重金属镉离子人工合成抗原荧光特性分析可为重金属人工抗原的检测提供参考。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　F4500荧光分光光度计，AA6650原子吸收分光光度计，UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；BS224S电子分析天平(十万分之一， Sartorius公司)；ZD2自动电位滴定(上海雷磁公司)；德国赛多利斯超滤管(6 mL， 北京泽平科技有限公司)。牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA）（Sigma公司)；1(4异硫氰苄基)乙烯基二胺N，N，N′，N′四乙酸(IEDTA，Dojindo公司)；Cd单元素物质标准溶液(国家标准物质研究中心)；实验用水均为二次蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

　　2.2 Cd2+人工抗原的合成

　　称取IEDTA 0.8 mg，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解并定容至2 mL，加入0.4 mg CdCl2，反应30 min。将2.5 g/L BSA缓慢加入到IEDTA和CdCl2的混合溶液中，搅拌20 min，于4 ℃下存放12 h，将混合液用分子量为30 kD的超滤管超滤（TrisHCl不断冲洗）除去未反应的小分子物质，用TrisHCl稀释至5 mL，－20 ℃冰箱保存产物。以HSA为载体蛋白质，按同样方法合成另一种Cd2+人工抗原CdIEDTAHSA。

　　2.3 荧光光度法测定Cd2+人工合成抗原

　　用TrisHCl缓冲液将载体蛋白质(HSＡ和BSA)和相应的人工抗原配制成一定浓度的溶液，激发波长295 nm，在（30±0.1）℃下绘制250～550 nm发射光谱；读取荧光强度并根据相关原理制作荧光相图；在同样条件下，采集偏振荧光光谱数据并根据公式定量计算偏振度和各向异性。

　　3 结果与讨论

　　3.1 Cd2+人工抗原的合成

　　利用IEDTA分子上具有的EDTA子结构与Cd2+形成稳定的六齿配体螯合物，同时通过其活泼的异硫氰根与载体蛋白质分子结合形成CdIEDTA蛋白质复合物。其反应原理见图解1。

　　定量Cd2+与过量螯合剂反应，未反应的Cd2+在碱性条件下生成沉淀，则仅有CdIEDTA与蛋白质发生反应。同时过量CdIEDTA可与载体蛋白质充分反应从而减少合成人工抗原中载体蛋白质含量。合成的Cd2+人工抗原不被超滤管滤过，不仅在光谱分析中表现出异于载体蛋白质分子的特征，而且在原子吸收分析中含有Cd2+信号，证明Cd2+人工抗原合成成功。
　　
　　3.2 荧光分光光度法检测结果

　　3.2.1 合成Cd2+人工抗原的荧光光谱

　　载体蛋白质是一种内源性荧光物质，偶联后人工抗原中的半抗原分子将影响载体蛋白质的荧光发射强度。据此可以判断人工抗原合成中蛋白质是否偶联成功及偶联程度的强弱[4]。从图１和图２可见，BSA和HSA在343 nm处有强的荧光发射峰，CdIEDTA在295 nm激发光下，没有出现发射光谱，而同浓度的Cd2+人工合成抗原在343 nm处的荧光强度呈规律性减弱，这说明Cd2+人工抗原合成中半抗原分子可能与有荧光特性的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸发生了相互作用，或者与其相近邻基团发生了反应，从而导致其载体蛋白质分子的荧光特征改变。
　　
　　表1和表2为根据两种合成Cd2+人工抗原特征光谱提取的荧光强度数据及定量计算结果。其中Ｆ是载体蛋白质荧光强度，F′是镉离子人工抗原的荧光强度，ΔF=F－F′为荧光强度减弱值，f=ΔF/F= F－F′/F荧光强度减弱比率，由此求得CdIEDTABSA荧光强度的平均减弱率为50%左右，而CdIEDTAHSA的平均减弱率为44%。可见，Cd2+人工抗原合成中，相同半抗原分子对不同载体蛋白质内源荧光强度的影响不同，说明载体蛋白质分子结构的改变程度有差异。

　　3.2.2 Cd2+人工抗原合成对载体蛋白质二级折叠结构的影响

　　荧光相图法可以直观地获得蛋白质折叠结构的变化信息，其原理是将发射波长分别为λ1和λ2时，蛋白质折叠结构发生变化时所测得的相应荧光强度I(λ1)对I(λ2)作图（荧光相图），据此分析蛋白质结构变化程度的方法[７，８]。若蛋白质去折叠过程符合“二态模型”，则荧光相图表现为一条直线；若蛋白质去折叠是一个序变过程，即符合“多态模型”，则荧光相图分别表现为两条或多条直线。一般地，λ1和λ2可以是荧光发射谱上任意波长，但是分别取处于荧光发射峰两个斜面上不同波长所获取的荧光相图更准确，并能提供更多的结构变化信息[９]。

　　CCdIEDTABSA， CCdIEDTAHAS对应于图2和图3 （corresponding to Figs.2 and 3）本工作通过荧光相图分析不同浓度Cd2+人工抗原中半抗原分子对载体蛋白质二级折叠结构的影响，实验取多组波长下的荧光强度作图并比较相关系数，得出I320－I365的相图最精确。由荧光相图(图３)可见，不同浓度Cd2+人工合成抗原的荧光相图为线性关系，说明合成过程中Cd2+诱导血清蛋白质的折叠变化过程符合典型的“二态模型”。

　　3.2.3 合成Cd2+人工抗原的偏振荧光光谱

　　偏振荧光光谱反映的是荧光体分子在激发波长下发射波长变化的偏振光谱。偏振荧光光谱可用偏振度P与各向异性r来度量并可以根据文献[１０]公式计算。

　　实验表明，BSA/HSA的偏振荧光光谱图表现为色氨酸残基的荧光，故可从偏振荧光光谱图的角度研究载体蛋白质偶联半抗原分子后Cd2+人工抗原分子中色氨酸残基的构象变化。分别测定Cd2+人工抗原、载体蛋白质的偏振荧光光谱并读取相应的偏振数据，进而计算荧光偏振度(P)及各向异性(r)，结Ｇ：计算Ｐ值和r值的校正因子(carrect factor for cacutating P and r).果列于表 3。表3 Cd2+人工合成抗原偏振荧光的偏振度(P)及各向异性(r)值（略）

　　
　　由表3可见，当半抗原分子偶联载体蛋白质生成Cd2+人工抗原分子后，荧光体的体积变大，转动速度变慢，则CdIEDTABSA和CdIEDTAHSA的偏振度及各向异性均有提高，这一现象说明Cd2+人工抗原分子的生成使载体蛋白质分子中色氨酸残基的微区构象发生了变化，色氨酸残基微区构象的改变直接导致了载体蛋白质分子构象一定程度的改变。同时，从表3数据可见，载体蛋白质分子不同，P及r值有一定的差异，表明载体蛋白质分子的结构差别可能会导致所生成的结合复合荧光体分子状态的差别，这说明偏振荧光光谱也能提供同一半抗原分子偶联不同载体蛋白质分子形成荧光物质在不同环境下的指纹信息，极大丰富了荧光光谱的选择性及灵敏性。

　　3.3 原子吸收检测结果

　　配制Cd2+标液系列溶液，在AAS上作标准曲线，分别取两种Cd2+人工合成抗原1 mL，稀释25倍后用AAS检测Cd2+的含量。经AAS检测，人工抗原CdIEDTABSA和CdIEDTAHSA中的Cd2+含量分别为20.0及26.0 mg/L，此结果说明Cd2+人工抗原合成成功。偶联比计算公式：ε=CdVma∶ ＣbV mb=Cama∶Cbmb (1)式中，ε为偶联比；Ca为镉离子的浓度；Cb为反应前蛋白质的浓度；V为反应后溶液体积；ma、mb分别为镉和载体蛋白质的平均分子量。计算CdIEDTABSA和CdIEDTAHSA的偶联比分别为11∶1～12∶1和14∶1～15∶1。

　　3.4 紫外光谱分析

　　用BCA试剂盒测定Cd2+人工抗原中蛋白质浓度，以TrisHCl缓冲液为空白对照，将CdIEDTA、BSA、HSA以及合成的Cd2+人工抗原用TrisHCl缓冲液配成一定浓度的溶液，用紫外分光光度计扫描。UV图谱见图４，BSA的特征吸收峰在278 nm附近，CdIEDTA的最大吸收峰在266 nm附近，偶联后的产物在260～280 nm波长范围内，波形趋于平缓，同时具备了半抗原和载体蛋白质的吸收特性。同样，HSA及其偶联物也具有此特性，从这些结果可以间接证明偶联成功。

　　经检测半抗原(Ch)的浓度为0.01 g/L，载体蛋白质(Cp)和人工抗原(Ca)的浓度为0.3 g/L，偶联比按如下公式推算：ε=(Aa266Kp278－Aa278Kp266)/(Aa278Kh266 －Aa266Kh278) (2)其中，Aa266是人工抗原在266 nm处的吸光度，Aa278 是人工抗原在278 nm出的吸光度。Kp278、Kp266、Kh266、Kh278分别为载体蛋白质和半抗原分子在266 和278 nm处的摩尔吸光系数。根据公式(2)计算人工抗原CdIEDTABSA和CdIEDTAHSA分子中半抗原与载体蛋白质的偶联比分别为11∶1和16∶1。

　　3.5 结论

　　采用荧光光谱方法表征Cd2+人工合成抗原，以偶联前后半抗原分子及载体蛋白质荧光强度的变化规律为依据，通过荧光相图及偏振荧光光谱测定了Cd2+人工抗原合成中半抗原分子对血清蛋白质二级折叠结构及分子构象的影响，并结合UV与AAS方法检测Cd2+人工抗原合成结果。几种检测方法相互印证并一致表明Cd2+人工抗原合成成功，偶联比在11∶1～16∶1之间（凝胶电泳实验显示同样结果，限于篇幅文中未列出相关数据及SDSPAGE泳带图）。与常规方法对比，荧光光谱方法具有简便、快速的特点，可以作为初步合成人工抗原的定性检测指标之一。

参考文献

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　　９ Yang Fang(杨 芳)， Liang Yi(梁 毅)， Yang Fang(杨 芳). Acta Chimica Sinica(化学学报)， 2003， 61(6): 803～807

　　１０ Yan Yuan (鄢 远)， Xu JinGou (许金钩)， Chen GuoZhen (陈国珍). Science in China(Series B)(中国科学)， 1997， 27(1): 16～22