柱前衍生高效液相色谱质谱法测定水稻中尼克烟酰胺含量

　　　　　　 作者：曹赵云 牟仁祥 陈铭学

【摘要】 建立了柱前衍生高效液相色谱质谱联用(HPLCMS)测定水稻中尼克烟酰胺含量的方法。样品中尼克烟酰胺经水提取后，与9芴甲基氯甲酸酯（FMOCCl）衍生，采用液相色谱质谱联用仪测定。系统研究了衍生剂浓度和衍生介质等条件对衍生效率的影响。通过优化流动相酸度和梯度洗脱等条件，提高了方法灵敏度。尼克烟酰胺在0.1～5.0 mg/L范围内呈良好的线性关系（r=0.9983），对水稻的根、茎、叶及大米的标准加入实验表明，方法的添加回收率在72.0%～89.2%之间； 相对标准偏差为2.3%～9.6%； 方法检出限为0.05 mg/kg。方法简便、准确可靠，可以满足水稻中生理水平尼克烟酰胺的定性定量分析。

【关键词】 尼克烟酰胺，水稻，柱前衍生，高效液相色谱，质谱

Determination of Nicotinamide in Rice by Precolumn
Derivatization and High Performance Liquid　ChromatographyMass Spectrometry

　　CAO ZhaoYun， MOU RenXiang，CHEN MingXue

　　(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center， Ministry of Agriculture，China National Rice Research Institute， Hangzhou 310006)

　　Abstract A method was developed for the determination of nicotinamide(NA) in rice by precolumn derivatization and high performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry(HPLC/ESIMS). After extraction with water， NA was derivatized by 9fluorenylmethoxycarbonyl(FMOCCl). In order to enhance the sensitivity， the derivatization was optimized regarding organic solvent content and amount of FMOCCl. The best HPLC conditions for the separation of NA in real samples were achieved using a C18 column and mobile phase which contained 0.1% formic acid. The MS experiments were performed in selected ion monitoring mode(SIM). The method shows good linearity over the range of 0.1－5 mg/L for NA with a correlation coefficient of 0.9983. The limit of determination(LOD) was 0.05 mg/kg. Precision and recovery studies were evaluated at three concentration levels for rice root， stem， leaf and unpolished rice. The recovery(n=5) ranged from 72.0% to 89.2% with relative standard deviations from 2.3% to 9.6%. The method is simple， highly selective and reliable， and can be used to determine NA in rice at physiological level.

　　Keywords Nicotinamide， rice， precolumn derivatization， liquid chromatographymass spectrometry

　　1 引 言

　　尼克烟酰胺（nicotianamine，NA），是植物体内的一种天然金属螯合剂[1]，在金属矿质元素由根系向地上部的长距离运输中发挥重要作用，同时也是调节植物对重金属元素吸收的关键物质[2]。已有研究表明，NA可参与Fe、Cu、Zn等多种金属元素的运输[3]，尤其是使植株对Cd、Ni等重金属的吸收有明显的抑制作用[4，5]。近年来，有关Cd在土壤食物中的迁移已成为Cd污染研究的热点[6]，而水稻是对Cd吸收较强的谷类作物[7]。因此，对水稻中NA进行快速、准确的测定，将为探明水稻中NA在提升稻米营养价值、降低重金属污染方面的作用提供重要的技术手段。

　　有关NA的测定方法，目前仅有少量报道，其主要是高效液相色谱法，测定样品也大多是NA含量较高的烟草等植物[8～11]。如Wada等[8]采用离子交换柱分离，柱后衍生荧光法；Jean等[9]采用离子交换柱净化，柱前衍生荧光法，并采用飞行时间质谱法分别测定了烟草等植物中NA含量［１１］。本实验中，样品通过水提取，将 NA与9芴甲基氯甲酸酯（FMOCCl）衍生化，生成可被反相柱保留的FMOCNA复合物，利用高效液相色谱单四极杆质谱联用技术（HPLCMS），解决了常规液相色谱测定NA时灵敏度低的问题，能满足水稻（根、茎、叶、籽粒）中生理水平尼克烟酰胺含量的测定。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1100高效液相色谱仪，1956B 四级杆质谱仪附电喷雾离子源(美国Agilent公司)；高速分散机（德国IKA公司）； R215旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）。

　　乙腈（色谱纯，德国 Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；0.2 mol/L硼酸盐缓冲液（分析纯，pH 9.0，Sigma公司）；实验室用水为MilliQ高纯水。衍生剂：9芴甲基氯甲酸酯（FMOCCl，分析纯，Sigma 公司），用乙腈将FMOCCl 配成0.6 g/L的衍生液；尼克烟酰胺标准品（加拿大TRC公司，纯度99%），用水配制成100 mg/L的标准储备液，使用前再配制为所需浓度。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 样品制备

　　本实验所用样品，均由中国水稻研究所培育。于分蘖盛期时采集水稻植株样品，用高纯水冲洗干净，并用纱布擦去表面水分，于4 ℃下封存，15 d内测定。于收获期采集水稻籽粒，脱壳后糙米置于干燥器中备用。水稻植株样品：将水稻植株按根、茎、叶分割为3部分，剪碎，再研磨捣细，称取2 g于50 mL塑料离心管中，加入20 mL水，在高速分散机中(10000 r/min)匀浆2 min后，以5000 r/min离心10 min，收集上清液，重复3 次。合并提取液于100 mL烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，在40 ℃左右浓缩近干，用水定容至10 mL后待衍生化。稻米样品：将糙米粉碎，过粒径为0.18 mm (80目)筛，称取0.5 g于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水，以下操作同于水稻植株样品。

　　2.2.2 衍生化反应

　　分别吸取100 μL提取液（或标准工作液）和200 μL硼酸盐缓冲液于2 mL离心管中，再加入200 μL 0.6 g/L FMOCCl溶液，立即旋涡振荡1 min，在20～30 ℃下静置1 h。过0.22 μm滤膜后供LC/MS分析。

　　2.2.3 色谱和质谱条件

　　ZORBAX Eclipse XDBC１８色谱柱（150 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）；流动相 A为0.1%甲酸水溶液; 流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱：0～5 min，95% A；5～25 min，5%～100% B。流速：0.3 mL/min。柱温25 ℃，进样量2 μL。

　　电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3.5 kV；氮气(N2 )流速 10 L/min；雾化气压力241.2 kPa；去溶剂温度350 ℃；正离子模式采集，碎片电压225 V；选择离子监测（SIM），定量离子m/z 748.2（[M+H]+），定性离子（同位素离子）m/z 749.2。

　　3 结果与讨论

　　3.1 衍生化条件优化

　　在碱性环境中，NA和过量的FMOCCl 反应后，形成稳定的衍生产物FMOCNA[8]。其反应式如下：

　　ＣＯＯＨＮＣＯＯＨＮＨＣＯＯＨＮＨ２＋ＯＯＣ〗pH 9.0ＣＯＯＨＮＣＯＯＨＮＲＣＯＯＨＮＨR R=FMOC

　　通过对衍生产物进行全扫描图分析，可以看到在选定的质谱条件下，很容易获得衍生产物的准分子离子峰（[M+H]+），m/z 748.2。考虑到灵敏度和选择性要求，方法选择m/z 748.2为定量离子，衍生产物的同位素离子m/z 749.2为定性离子，两者丰度比为100∶48.5。衍生产物的选择离子流图和质谱图见图1。

　　实验发现，衍生剂浓度和衍生体系的水含量对分析灵敏度将产生明显影响。NA溶于水而不溶于乙腈，FMOCCl则反之，水含量过低则NA析出;而过高的水含量除FMOCCl结晶析出外，还会形成FMOCOH[12]，进而降低衍生效率。因此，本实验考察了衍生剂浓度和衍生介质对NA的衍生效率的影响（见图2）。

　　从图２的曲线1可以看出，随着衍生剂浓度增加，分析灵敏度也随之增加，当浓度达到0.6 g/L时趋于平缓，但过多的衍生剂将增加色谱柱负荷；而从曲线2可见，在相同的衍生剂浓度下，含水量低的体系，灵敏度明显低。因此，为获得较高的衍生效率，本实验选择衍生剂浓度为0.6 g/L，水含量为60%的衍生体系为衍生条件，即V(样液)∶V(缓冲液)∶V(FMOCCl)＝1∶2∶2。此外，在碱性条件下pH对衍生效率无明显影响（本方法取pH=9.0），衍生反应在20～30 ℃下进行1 h即可完成，其衍生产物较为稳定，可在0～5 ℃下存放1个月。

　　3.2 色谱条件的优化

　　本实验采用二元梯度洗脱，进样后的5 min内用95%水相洗脱出样液中的大量的盐以及缓冲试剂，而后逐渐增大乙腈比例，洗脱目标物。另外，通过向流动相中添加甲酸，使衍生产物预先形成[M+H]+而提高分析灵敏度。对流动相中含0～0.5%甲酸进行了比较，发现0.1%甲酸较为适合。

　　3.3 方法线性关系和检出限

　　分别将当日配制好的0.1、0.25、0.5、1.0和5.0 mg/L NA标准系列溶液衍生后测定，用定量离子峰面积和浓度做校正曲线。结果表明：在0.1～5.0 mg/L范围内，NA的质量浓度和定量离子峰面积呈良好的线性关系，其中线性回归方程y=240386.05x+12540.21；相关系数r=0.9983。检出限为0.05 mg/kg（S/N=3）。

　　3.4 实际样品分析和标准加入的回收率

　　向稻根、茎、叶和糙米样品中加入NA标准溶液进行标准加入回收实验，加标水平见表1。每个浓度重复5次（n=5），按上述实验步骤进行样品的提取、衍生化分析，测定结果列于表1。结果表明，本方法测定水稻中的NA含量的回收率在72.0%～89.2%之间，各添加水平的精密度均小于10％，能满足测定要求。表1 水稻中NA的含量、加标回收率和精密度（略）

　　分别对水稻根、茎、叶和糙米提取液以及标准液进行测定，其中两种样品总离子流图见图3。结果表明，在水稻样品中均能检到NA的存在，以水稻根部（鲜重）含量最高，为8.64 mg/kg；茎、叶和糙米中
图3 水稻样品中根(A)和茎(B)提取液的总离子流图
Fig.3 Total ion chromatograms for extraction of root (A) and stem (B) in rice含量分别为4.36、1.32和14.6 mg/kg，数据表明，本方法能满足水稻中生理水平NA测定的灵敏度要求。

　　4 结论

　　本研究提供了一种用LC/ESIMS测定水稻中NA 的检测方法。通过柱前衍生手段，降低被测物的极性，改善在反相C18柱上的保留。与以往的HPLC方法相比，本方法的样品处理过程大为简化，方法选择性明显改善。另外，LCMS同时采用保留时间和离子丰度比进行定性，提高测定数据的可靠性；通过对稻根、茎、叶和糙米的测定（其相对标准偏差均小于10%，回收率在72.0%～89.2%之间）表明，本方法具有灵敏度高，操作简单等优点，能满足水稻中NA含量测定的要求。

参考文献

　　1 Wiren N V， Klair S， Bansal S， Briat J F， Khodr H， Shioiri T， Leigh R A.， Hider R C. Plant Physiol.， 1999， 119(3): 1104～1114

　　２ Takahashi M， Terada Y， Nakai I， Nakanishi H， Yoshimura E， Mori S， Nishizawa N K. Plant Cell， 2003， 15(6): 1263～1280

　　３ Pich A， Scholz G， Stephan U W. Plant Soil， 1994， 165(2):189～196

　　４ Kim S， Takahashi M， Higuchi K， Tsunoda K， Nakanishi H， Yoshimura E， Mori S， Nishizawa N K．Plant Cell Physiol.， 2005， 46(11):1809～1818

　　５ Douchkov D， Gryczka C， Stephan U W， Hell R， Bumlein H. Plant Cell Environ.， 2005， 28(3): 365～374

　　６ Shi Jing（史 静）， Li ZhengWen(李正文)， Gong WeiQun（龚伟群）， Pan GenXing（潘根兴）. Asian Journal of Ecotoxicolog(生态毒理学报)， 2007， 2（1）: 33～34

　　７ Chancy R L， Reeves P G， Ryan J A， Simmons R W， Welch R M， Angle S J. Biometals， 2004， 17(5): 549～553

　　８ Wada Y， Kobayashi T， Takahashi M， Nakanishi H， Mori S， Nishizawa N K. Biosci. Biotech. Bioch.， 2006， 70(6): 1408～1415

　　９ Jean M L， Schikora A， Mari S， Briat J F， Curie C. Plant J.， 2005， 44(5): 769～782

　　１０ Shojima S， NishizawaN K， Mori S. Plant Cell Physiol.， 1989， 30(5): 673～677

　　１１ Wada Y， Yamaguchi I， Takahashi M， Nakanishi H， MoRi S， Nishizawa N K. Biosci. Biotech. Bioch.， 2007， 71(2）: 435～441

　　１２ Nedelkoska T V， Low G K C. Anal. Chim. Acta， 2004， 511(1): 145～153