石英微米晶粒电泳微柱的制备及其电泳分离

　　　　 作者：李连 何友昭 淦五二 王晓葵 谢海洋 高勇

【摘要】 研究了内径2 mm石英管填充均匀石英微米晶粒的电泳微柱制备及其电泳分离的可行性。石英微米晶粒用水热法合成。含30%甲醇的15 mmol/L Na2HPO4为电泳缓冲液（pH 115），对无需衍生的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸进行了微柱电泳分离和紫外吸收检测。检出限分别为0038、 021和020 μmol/L；　色氨酸的分离效率为44 × 104塔板数/m，电泳微柱的样品容量达到35 μL， 且有较好的分离重现性。对未填充石英微粒， 填充平均粒度360 μm石英砂和长9 μm石英微米晶粒的电泳微柱的热效应进行了讨论。实验结果表明，在电泳微柱中填充石英微米晶粒可抑制大柱径电泳的热效应，增大样品容量，提高检测灵敏度。此微柱电泳技术可作为现场、实时和便携式电动流动全分析系统的高效分离手段，适合大体积和低浓度样品分析。

【关键词】 微柱电泳，石英微米晶粒，水热合成，热效应，电动流动全分析系统，　氨基酸

　　Abstract The preparation of electrophoretic microcolumn and its application to the electrophoretic separation of amino acids with a 2mm I.D. fusedsilica microcolumn packed with uniform quartz microncrystal prepared by hydrothermal synthesis are reported. With 15 mmol/L disodium phosphate buffer solution (pH 115) containing 30% (Ｖ/Ｖ) methanol， the tryptophan， phenylalanine and tyrosine were separated by the microcolumn electrophoresis and detected by an UV spectrophotometer without derivatization. The limits of detection were 0038， 021 and 020 mol/L， respectively. The separation efficiency of tryptophan was 44×104 plates/m. The sample capacity of the electrophoretic microcolumn achieved 35 μL. The precisions of the microcolumn electrophoresis were satisfactory. The thermal effects of the electrophoretic microcolumn that without packing， packed with 360 μm quartz sand and with 9 μm length quartz microncrystal were discussed， respectively. It was found that the electrophoretic microcolumn packed with quartz microncrystal was able to inhibit Joule heat， increase sample capacity and enhance detection sensitivity. The microcolumn electrophoresis is one of the highperformance separation techniques for an insitu， realtime and portable electrokinetic flow analysis system.

　　Keywords Microcolumn electrophoresis， quartz microncrystal， hydrothermal synthesis， thermal effect， electrokinetic flow analysis system， amino acids

　　1 引 言

　　毛细管电泳具有高效、快速和低耗等优点，并具备多种分离模式，因此得到广泛应用。但毛细管电泳也具有样品容量小、检测灵敏度差等弱点，这是由电泳通道细和检测光程短造成的。但大通道电泳的热效应会引起柱温升高，温度梯度增大，生物样品变性，甚至产生气泡阻断电流。增大的温度梯度会影响与温度相关的化学物理参数，造成电渗和电泳径向速度差异，样品区带展宽，分离效率降低[1]。由于区带热展宽与电泳通道内径的６次方成正比[2]，增大柱径必将迅速增加热效应和热展宽。

　　本研究组曾使用填充细石英砂的毫米内径硅胶整体柱进行反相色谱和电色谱分离[3，4]，尽管热效应被有效地抑制，检测灵敏度提高，但由于石英砂的形状不规则和粒度过大，整体柱的分离效率不理想。本研究以2 mm内径石英管填充水热合成均匀石英微米晶粒来制备电泳微柱，并考察其电泳分离的可行性，讨论了电泳微柱热效应。为评价此电泳技术，对无需衍生的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸进行了电泳分离和紫外吸收检测。实验表明，此微柱电泳可有效抑制电流热效应，提高样品容量和检测灵敏度，可作为电动流动全分析系统[5]的高效分离手段。本系统用电渗泵[6]输送溶液，固相萃取等预处理，微柱电泳或整体柱色谱/电色谱分离和光纤光谱仪检测，具有简便、模块化、多功能、可便携和易操纵等优点，可用于现场和实时分析。此电泳技术适合大体积和低浓度的环境样品分析，也可发展成制备电泳。

　　2 实验部分

　　21 仪器与试剂

　　全分析系统由电泳微柱单元、自制电渗泵、二台DYYⅢ4电泳仪（20~1600 V，北京六一仪器厂）、UV9100分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）、控制和数据采集计算机及161T031三通电磁阀（美国Nreseach公司）组成。采用50 μL液相色谱微量进样器进样(见图1)。
　　
　　电泳微柱单元由100 mm×2 mm I.D.填充石英微米晶粒的石英分离柱（下段烧结20 mm×15 mm I.D.石英检测管）、含两片4 mm焦距石英透镜固定于检测管的光学单元、聚醚醚酮流通接口和缓冲液池组成。电渗泵吸入和输送缓冲液的流速分别为20 mL/min(500 V)和04 mL/min(100 V)，4 h流量相对标准偏差为40%，其工作电压由电泳仪提供。聚醚醚酮接口可引入分离缓冲液，提供电泳电压，经可封闭小孔注入样品； S2200型超声清洗器（120 W， 35 kHz， 上海杰理科技有限公司）对样品和缓冲溶液超声除气。SG2310高温炉（3 kW，1000 ℃，上海立新电器厂）用于水热法合成石英微米晶粒； 02 μm孔径尼龙膜（美国Millipore公司）； 硅胶粉（上海麦纽内斯科技股份有限公司）； 360 μm石英砂（江苏连云港华成石英制品有限公司）。甲醇为色谱纯，其它化学试剂均为分析纯（上海化学试剂公司）。实验用水为三次蒸馏水（SZ3，上海沪西分析仪器厂）。色氨酸、苯丙氨酸与酪氨酸储备液浓度分别为125、500和500 mmol/L，用蒸馏水稀释储备液制备混合标准溶液。分离缓冲液为15 mmol/L Na2HPO4（pH 115）+30%（V/V）甲醇。05 mmol/L硫脲作电渗流标记物。电渗泵载流为05 mmol/L 六亚甲基四胺（HMTA）水溶液，每次分析工作结束应将泵内载流更新。

　　22 石英微粒电泳微柱的制备

　　将石英微粒依次用01 mol/L HCl、蒸馏水和20 mmol/L NaAc（pH 30）填充缓冲液，清洗并浸泡6 h。以01 mol/L HCl、 01 mol/L NaOH和蒸馏水依次冲洗电泳微柱，60 ℃烘干。在分离柱与检测管间垫两层尼龙滤膜，避免石英微粒流失。将石英微粒和填充缓冲液的悬浮液缓慢注入分离柱，注入过程中轻轻敲击电泳柱；当整柱充满石英微粒后，在电渗流（500 V）和轻敲电泳柱双重作用下，使柱内石英微粒进一步填充紧密均匀。最后再用尼龙膜和05 mm厚的尼龙过滤片封住分离柱上端。

　　23 石英微米晶粒的制备

　　参照文献[7]中石英纳米晶粒的制备方法，石英微米晶粒用水热法在36 cm3镍内衬的不锈钢高压釜中合成。18 g硅胶粉加入27 mL 041 mol/L KOH，10 ℃/min升温至350 ℃，恒温2 h，将高压釜冷却至室温。产物用水和乙醇依次清洗，干燥。用X射线衍射仪（40 kV，40 mA）测定石英微米晶粒的晶态，放大2000倍电镜照片如图2所示，石英微米晶粒的平均尺寸为9 μm×4 μm。

　　24 微柱区带电泳的分离步骤

　　分离前，标准溶液和缓冲溶液超声除气5 min。电泳微柱用分离缓冲液充分平衡。分离电压800 V，用微量进样器将混合样品溶液通过聚醚醚酮接口定量注入于分离柱上端，3种氨基酸进行电泳分离，用分光光度计在216 nm检测，计算机记录信号。分离间隙，电泳微柱用分离缓冲液电动冲洗5 min。毫安表测量电泳电流。当电泳微柱的分离效率降至初始值的50%时，分离柱依次用01 mol/L HCl、01 mol/L NaOH及分离缓冲溶液电动冲洗。

　　3 结果与讨论

　　31 电泳微柱中的热效应

　　考察未填充石英微粒， 填充平均粒度360 μm石英砂和长9 μm石英微米晶粒电泳微柱的电流电场强度关系曲线，结果见图3。

　　在相同场强下，图3曲线1的电流远大于后两者，且增长更快。曲线1在10~60 V/cm场强范围内，斜率明显增加。这表明未填充的电泳微柱中，热效应使缓冲液电导率增大，电流快速增加，热效应影响显著。曲线2表明随填充石英微粒的粒度增大，多孔率、热效应和电流曲线斜率变大，电流曲线偏离线性。但曲线3的场强升至120 V/cm，电流曲线斜率基本保持恒定。实验表明，填充石英微米晶粒的电泳微柱可明显降低焦耳热。

　　32 电泳微柱中电场强度对电渗流的影响

　　在微通道电泳中，电渗流速是影响电泳分离的重要参数，可用下式表示：veo=ε0εrζηE(1)式中，ε０为真空介电常数， εr为缓冲液相对介电常数， ζ为zeta电势， η为缓冲液粘度系数，Ｅ为电场强度。
　　
　　为评价填充石英微米晶粒电泳微柱的热效应，以硫脲为电渗流标记物，研究场强对电渗流速的影响。根据式(1)，其它条件不变， 电渗流速与场强呈线性关系。但由于溶液粘度随温度升高而减小， 若热效应过大，电渗流场强曲线在高场强段向上弯曲。在本研究中，电场强度由２０ V/cm升至120 V/cm仍与电渗流呈线性关系， 说明填石英微米晶粒可有效抑制电泳微柱的热效应。

　　33 分离条件

　　考察05~175 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液在pH 100~120，以及甲醇浓度在0~40%(V/V)范围内对氨基酸分离的影响。当缓冲液pH值为100~115时，加入的NaOH导致溶液离子强度增加，电渗流降低，扩散系数和表观迁移速度的降低导致柱效和分离度增加。当pH＞115时，由于过高离子强度和焦耳热的影响，分离度逐渐降低。同样由于离子强度的原因，当缓冲液浓度由05 mmol/L增至15 mmol/L时，降低的扩散系数和表观迁移速度使分离度改善；当缓冲液浓度高于15 mmol/L时，热效应会使分离度和分离效率降低。随着甲醇浓度的增加，分离度改善；当甲醇浓度为30%时，可获得最佳分离度。综合考虑氨基酸的分离效率和分离度，选择15 mmol/L Na2HPO4（pH 115）+30%甲醇（V/V）为分离缓冲液。

　　34 微柱电泳的分离特性

　　为考察填石英微米晶粒电泳微柱的分离性能， 将无需衍生的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸进行了微柱电泳分离。图４为色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的电泳微柱电泳分离谱图。谱图的分离峰形对称，无拖尾现象。色氨酸的分离效率为44×104塔板数/m。表明填充石英微米晶粒电泳微柱能够明显改善热效应，达到满意的分离效率。表1为同一石英微米晶粒微柱以及微柱间电泳分离的样品保留时间和峰高的相对标准偏差。结果表明，填充石英微米晶粒电泳微柱具有较好的分离重现性。表1 微柱电泳分离的重现性（略）

　　根据色谱理论的样品容量定义，增大进样体积至40 μL，峰宽计算得电泳微柱的样品容量为35 μL。在进样量为30 μL，各氨基酸浓度在07~20 μmol/L范围内，测得色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的检出限分别为0038、021和020 μmol/L（S/N=3）。结果证明，填充石英微米晶粒的微柱电泳结合普通紫外可见分光光度计测定非衍生氨基酸的检出限优于毛细管电泳衍生紫外可见法[8]，并与高效液相色谱衍生紫外可见法[9]接近。与毛细管电泳质谱法[10]相比，除酪氨酸的检出限略差之外，色氨酸和苯丙氨酸的检出限都较优。因此，微柱电泳适合大体积和低浓度样品分析，如环境样品，食品，工业样品等，并可进一步发展成制备电泳。

参考文献

　　1 Xuan X C. Electrophoresis， 2008， 298: 33~43

　　2 Knox J H， Grant I W. Chromatographia， 1987， 24: 135~143

　　3 Deng Ning（邓 宁）， He YouZhao（何友昭）， Wang XiaoKui（王晓葵）， Wang Lei（王 蕾）， Su QingDe（苏庆德）. Chem. J. Chinese Universities（高等学校化学学报）， 2005， 26(11): 2019~2022

　　4 Wang Lei（王 蕾）， He YouZhao（何友昭）， Wang XiaoKui（王晓葵）， Deng Ning（邓 宁）， Fu GuoNi（付国妮）， Gao Yong（高 勇）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化学）， 2006， 34(10): 1426～1428

　　5 He YouZhao（何友昭）， Wang XiaoKui（王晓葵）， Deng Ning（邓 宁）， Wang Lei（王 蕾）， Han Fang（韩 芳）. Chinese Patent （中国专利）， ZL2005100386775， 2008

　　6 He YouZhao（何友昭）， Gan WuEr（淦五二）， Zhang Min（张 敏）， Zheng MingZhu（郑明珠）， Zeng RongHui（曾荣辉）， Jin Gu（金 谷）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化学）， 1998， 26(2): 125~128

　　7 Yanagisawa K， Zhu Y， Onda A， Kajiyoshi K. J. Mater. Sci.， 2004， 39: 2931~2934

　　8 Komarova N V， Kamentsev J S， Solomonova A P， Anufrieva R M. J. Chromatogr. B， 2004， 800: 135~143

　　9 GómezAlonso S， HermosínGutiérrez I， GarcéaRomero E. J. Agric. Food Chem.， 2007， 55: 608~613

　　10 Soga T， Kakazu Y， Robert M， Tomita M， Nishioka T. Electrophoresis， 2004， 25: 1964~1972