微流控芯片电解质介导连接在柱式电导检测

　　　　 作者：童艳丽 李偶连 刘翠 李想 杨秀娟 陈缵光

【摘要】 研制了一种新型在柱式微流控芯片电导检测装置，利用电解质介导连接分离样品和检测电极，避免了电极的污染和中毒。在芯片的分离通道上设有双T型通道和十字型通道，分别用于进样和检测。检测电极分别置于十字通道口两端的储液池中，电极与芯片相互独立，简化了实验装置，便于电极的更换和清洗。采用缓冲溶液作介导电解质，减小了因两者浓度或种类不同而导致的基线漂移。与非接触电导接触相比，本装置在较低的检测电压（2.5~4.0 V）和频率（700~1700 Hz）范围即可获得相对灵敏的信号。在15 mmol/L MESHis(pH 5.8)的缓冲体系下，K+与Na+的检出限分别为0.5和0.1 μmol/L。

【关键词】 电导检测，微流控芯片，芯片毛细管电泳

　　Abstract A new oncolumn conductivity detection for microchip capillary based on the accessional solution conductor between separation channel and electrodes was designed. In this detection， the carrier electrolyte solution was chosen as conductor to eliminate large drifts of the detection signals， that because different composition or concentration can lead to transport processes(diffusion and electromigration) between the carrier electrolyte solution and mediator. The separation channel incorporated a dualT and a cruxchannel， dualT was used for sample introduction， and the cruxchannel was used for detection. The sensing electrodes connected to separation channel through the cruxchannel and obtained the potential different of conductivity. This method avoids integrating the sensing electrodes directly within the separation channel and prevents any direct contact of the electrodes with the sample. It not only avoids electrode reactions but also is convenient for washing and replacing electrodes. In addition， the signals， contrary to contactless conductivity detection， can be detected in the low excitation voltage(2.5－4.0 V) and frequency(700－1700 Hz) range. In the buffer solution of 15 mmol/L MESHis(pH 5.8)， the detection limits was 0.5 and 0.1 μmol/L for K+ and Na+.

　　Keywords Conductivity detection， microchip， chip electrophoresis

　　1 引 言

　　近年来，微流控芯片技术发展迅速。微流控芯片中常用的检测方式有紫外吸收检测、激光诱导荧光检测[1，2]、化学发光检测[3]、电导检测[4~7]、安培检测[8，9]和电化学发光检测[10]等，电导检测易微型化和集成化，通用性强，所以颇受关注。电导检测分接触式[4]和非接触式[5~7]两种。在接触式电导检测装置中，电极容易污染和中毒，检测性能受到影响。非接触电导检测可避免上述问题，但芯片加工和制作复杂。利用电解质介导连接检测电极与样品，也是一种避免电极污染和钝化的方法[11]。Wu等[12]设计了双T形通道玻璃芯片，当样品流经双T形通道区间时，此区间的电阻发生变化，相应从分离高压上所分配获得的电压发生变化，从而获得检测信号。但检测信号受分离高压稳定性的影响。本研究采用十字通道作检测通道，两检测电极间没有从分离高压上获得电压差，不受分离高压稳定性的影响，且本装置对仪器元件的要求简单，适合于各种材料的芯片。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　玻璃蛇形弯通道芯片（浙江大学微分析研究所协助制作）；芯片毛细管电泳仪高压源（自制）；YDS996A函数信号发生器（仪征市培明电子仪器厂）；电导检测装置（自制）；数据工作站（自制），数据记录和处理在普通的PC微机和PCL711B型A/D卡（台湾EVOC公司）上完成；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

　　2（N吗啉代）乙磺酸（MES，上海生工生物工程有限公司）；组氨酸（His，上海润捷化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯，香港分装）；其它试剂为分析纯（广州化学试剂厂）。溶液用二次蒸馏水配制，使用前超声脱气10 min，并用0.22 μm孔径的滤膜过滤。

　　2.2 芯片材料与结构

　　芯片的材料为玻璃，其结构如图1所示。芯片的通道宽70 μm，深50 μm； 蛇形分离通道长110 mm，有效分离长度（h~g）100 mm，检测通道（e~f）长为10 mm (g~f:2.5 mm， g~e:7.5 mm)； 双T型进样通道间距（h~i）为0.25 mm。储液槽a和b用于放置分离电极，储液槽c和d用于放置进样电极，储液槽e和f用于放置检测电极。

　　2.3 实验方法

　　整个检测装置放置在水平桌面上，芯片每次使用前依次用0.1 mol/L NaOH、蒸馏水和缓冲溶液分别冲洗10、5和10 min。将微通道充满缓冲溶液，然后于每个储液槽中注入25 μL缓冲溶液，再将电极插于相应的储液槽中平衡5 min。随后样品槽中的溶液换成相同体积的样品溶液，尽量确保各槽液面间平衡。最后进行电泳实验，采用300 V电压进样10 s，根据需要采用适当的分离高压分离检测。

　　3 结果与讨论

　　3.1 装置设计

　　整个装置设计简单，检测电极(激发电极和接收电极)分别与外置的函数信号发生器和信号放大器连接，除函数信号发生器外，其它元件都集成在密闭的金属盒内。进样电压和分离电压都由外置高压电源提供。

　　电路连接关系如图1所示。检测时，电极置于相应的储液槽中，函数信号发生器(正弦波)按照设定的频率和电压施加在ef通道上，接收电极所获得的电流信号经检测器中的CV转换后，再通过整流和放大，最终将检测信号输入到计算机中。芯片检测通道的内径和分离通道的内径相同，目的是为了在保证检测容积量的同时尽量减小分离组分在ef通道中的扩散现象。由于ef通道和ab通道间相互连通，分离电场中存在的少量交流信号即可干扰ef通道中的信号检测，因而在高压零线上分出一只带有100 pF电容的线路接地，滤过分离电场中存在的少量交流电场，而不影响其直流电场。

　　3.2 介导电解质选择

　　装置通过电解质介导连接分离通道和检测通道，因此电解质的选择是实验的关键问题。本实验分别选用与分离缓冲溶液不同和相同种类、浓度的溶液作介导电解质。由于分离通道和检测通道相互连通，当缓冲溶液和介导电解质的浓度或种类不同时，各通道溶液间容易形成梯度扩散或组分混合等现象，导致基线的漂移严重，且噪音增大，因而实验选取分离缓冲溶液作介导电解质，与Bodor等[11]报道的相同。考察了15 mmol/L的TrisH3BO3、HAcNaAc和MESHis 3种缓冲体系。TrisH3BO3体系，基线的噪音小，但分析无机离子时，样品峰高低于MESHis体系；HAcNaAc体系，基线噪音大，严重影响样品检测和峰形的判断；MESHis体系，基线噪音和样品峰形基本满意。因此，选择MESHis为缓冲溶液和介导电解质。考察了5、10、15和 20 mmol/L MESHis缓冲溶液浓度对基线噪音的影响。基线噪音随缓冲溶液浓度的增加而增大，当MESHis浓度增加到20 mmol/L时，样品信号减弱，且噪音增大。为保证缓冲能力和分离效能，本实验以15 mmol/L MESHis（pH 5.8）为缓冲溶液和介导电解质。在15 mmol/L MESHis介导电解质中加入少量NaCl(1~5 mmol/L)时，基线噪音随NaCl浓度的增加而增强，且基线产生飘移，表明介导电解质应尽量选取离子强度相对较低的缓冲溶液。

　　3.3 系统条件的优化

　　本装置采用电解质介导连接检测电极和样品，无需很高的检测电压和频率。选正弦波作输出波形，硬件限制最大激发电压仅有7.0 V。当检测频率&>5000 Hz时，基线噪音较大，且检测信号弱，因而未考虑更高的检测电压和频率。以信噪比为选择条件，优化选取检测电压和频率的范围分别为2.5~4.0 V和700~1700 Hz（如图2和图3）。由于通道间相互连通，分离高压影响检测信号，若样品流速大于一定值时，ef通道的存在不会影响样品在ab通道中迁移[1２]。当分离电压小于1.0 kV时，样品的流速不够，样品区带增长，在ef通道中的扩散相对较多，电泳电流在60 min内由3.4 μA衰减至0.9 μA。而大于2.0 kV时无明显电流衰减，电泳电流稳定。分离电压对电导响应的影响如图4所示，在2.0~3.0 kV间均可获得较好结果。

　　3.4　芯片检测系统的性能和重现性

　　缓冲溶液的配制误差对实验重现性的影响较大，在优化实验条件下，同一次配制的缓冲溶液，对1.0 μmol/L Na+重复进样3次，出峰时间和峰高的RSD值分别为2.02%和2.72%。对K+和Na+的检出限分别是0.5和0.1 μmol/L。如图5所示，在3.0 kV的分离电压条件下分离检测了Ca2+和Na+。

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