作者：尤昭玲，曾晶，游 卉，查亚萍，邓海燕，李丹
【摘要】 目的 观察妇科止血消痛颗粒对药物流产后大鼠血清雌激素、孕激素含量及子宫组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达的影响，探讨其治疗药物流产后子宫复旧不全的机制。方法 选用SD雌性大鼠72只，随机分为空白组、模型组、产妇康组及妇科止血消痛颗粒高、中、低剂量组。建立大鼠药物流产后子宫复旧不全病理模型。采用放射免疫法检测大鼠血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)含量，免疫组化法检测各组大鼠子宫组织中ER、PR的表达水平。结果 模型组大鼠血清中E2、P含量及子宫组织中ER、PR表达均低于空白组。妇科止血消痛颗粒高、中、低剂量组用药后，血清中E2含量升高，P含量降低，差异有统计学意义(P&<0.05，P&<0.01)，与产妇康组比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。妇科止血消痛颗粒中、低剂量组可升高ER的表达，妇科止血消痛中剂量组可升高PR的表达(P&<0.05， P&<0.01)。结论 大鼠药物流产后子宫复旧不全模型E2、P、ER、PR均降低，可能影响了产后子宫内膜的修复，妇科止血消痛颗粒通过升高E2、ER、PR水平，降低P水平，发挥治疗药物流产后子宫复旧不全的作用。
【关键词】 药物流产;子宫复旧不全;妇科止血消痛颗粒;雌二醇;孕酮;雌激素受体;孕激素受体;大鼠
Abstract：Objective To explore the mechanism of Fuke Zhixuexiaotong Keli in rats model of medical abortion， by observing the content of E2， P in serum and the expression of ER， PR in uterine tissues. Methods Seventy-two SD female rats were randomly pided into 6 groups：blank group， model group， Chanfukang group， Fuke Zhixuexiaotong Keli high-， middle- and low-dose group. The model of medical abortion was established. The content of E2， P in serum were detected by the method of immunoradiometric assay (IRMA) and the expression of ER， PR in uterine tissues by the mothod of immunohistochemicalstaining (IHC). Results Both the content of E2， P in serum and the expression of ER， PR in uterine tissues of the model group were lower than the blank group. The content of E2 raised and P reduced in Fuke Zhixuexiaotong Keli high-， middle-， low-dose group with significant difference (P&<0.05， P&<0.01)， and no statistical meaning with Chanfukang group (P&>0.05). The expression of ER was raised in Fuke Zhixuexiaotong Keli middle- and low-dose group， and the expression of PR was raised in Fuke Zhixuexiaotong Keli middle-dose group (P&<0.05， P&<0.01). Conclusion The content of E2， P， ER and PR was reduced in rats medical abortion and postpartum uterine redintegration incomplete model， that may affect the repair of postpartum uterine endometrial. Fuke Zhixuexiaotong Keli played a role in curing uterine redintegration incomplete caused by medical abortion， by raising the content of E2， ER and PR， and reducing the content of P.
Key words：medical abortion;incomplete puerperal involution of uterus;Fuke Zhixuexiaotong Keli;estrogen;progestin;estrogen receptor;progestin receptor;rats
米非司酮配伍米索前列醇终止早孕已广泛应用于临床。米非司酮通过与孕酮受体结合而起到阻断孕酮的作用，引起蜕膜和绒毛变性，导致出血和体内人绒毛膜促性腺激素(hCG)水平下降，继发黄体溶解，内源性前列腺素释放，促进宫缩和宫颈软化[1]，达到终止早孕的目的。米索前列醇为前列腺素E1衍生物，可刺激宫颈纤维组织释放多种弹性蛋白酶而软化官颈，使之易于被扩张，同时可兴奋子宫肌，使子宫平滑肌收缩[2]。但药物流产后子宫出血时间长的不良反应愈来愈明显，有研究发现，米非司酮等孕激素拮抗剂具有非竞争性拮抗雌激素的特性，可能使产后雌孕激素水平失调，受体水平下降，使子宫内膜不同步，子宫内膜修复出现障碍;其敏感性降低而减弱前列腺素对子宫的收缩作用，蜕膜不易排出，滞留官腔，导致药物流产后子宫出血时间延长[3]。中医根据药物流产后出血的病证特点，认为其基本病理为气虚血瘀。本实验用药物流产大鼠模型作为研究模型，观察了妇科止血消痛颗粒对药物流产大鼠模型雌二醇(E2)、孕酮(P)、雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)的影响，以探讨其治疗药物流产后子宫复旧不全的机制，现将实验结果报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
选取清洁级大白鼠，雌雄兼备，鼠龄3个月以内，体重180～220 g，雌、雄比例为2∶1，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2009-0004。由专人清洁级饲养，饲料由湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物
妇科止血消痛颗粒(党参、黄芪、蒲黄、鹿衔草、马鞭草等)浸膏浓度为4.43 g/g，临床用量为52 g/d;实验用药大、中、小剂量组含原药材量分别为4.68、9.36、18.72 g/kg，实验当日用白开水配制，湖南中医药研究院提供，批号20090328。产妇康，临床用量60 g/d，给药量5.4 g/kg，深圳三顺制药有限公司生产，批号080802。米非司酮片，25 mg/片，北京紫竹药业有限公司生产，批号43081510，灌胃前用蒸馏水配制成1.66 g/L的混悬液备用。米索前列醇片，0.2 mg/片，北京紫竹药业有限公司生产，批号43080910，灌胃前用蒸馏水配制成0.01 g/L的混悬液备用。
1.3 试剂
E2、P放射免疫试剂盒，北京华英生物技术研究所提供，批号20090620;ER、PR免疫组化试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司提供，批号bs-0725R、bs-0111R。
1.4 仪器
LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)，MIAs医学图像分析系统(北航公司)，Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司，MoticB显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)等。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献
[4]，将大鼠按雌、雄2∶1的比例合笼，次晨观察阴栓，并进行阴道涂片检查[5]，以明确查见阴栓者或发现精子的当日为妊娠第1日。所有妊娠大鼠均在同样环境下采用同样饲料分笼饲养，在妊娠第7日分别灌胃米非司酮16.6 mg/kg体重(8:00)和米索前列醇0.1 mg/kg(18:00)，待孕囊排出，造成药物流产模型。2.2 分组与给药
大鼠随机分为空白组、模型组、产妇康组及妇科止血消痛颗粒低、中、高剂量组(以下简称妇低、妇中、妇高组)，每组12只。妇科止血消痛颗粒低、中、高剂量组分别于造模后第1日开始，每日灌胃4.68、9.36、18.72 g/kg妇科止血消痛颗粒，相当于成人等效剂量1、2、4倍，灌胃体积为8 mL/(kg·d)。产妇康组给予5.4 g/kg产妇康灌胃，模型组和空白组灌服蒸馏水8 mL/(kg·d)。每日灌胃1次，连续7 d。
2.3 指标检测
2.3.1 放射免疫法 检测大鼠血清中E2、P的含量。
2.3.2 子宫内膜组织病理学检查 常规HE染色，处死大鼠后，切取2 cm大小的子宫组织，置于4%福尔马林固定液中固定24 h后，再用70%、85%、95%、100%(无水1)、100%(无水2)的乙醇依次脱水，入二甲苯透明40 min，软蜡中浸1 h，石蜡包埋，蜡块入冰箱冷冻柜12 h后用石蜡切片机做连续冠状切片，厚度为4 mm，做HE染色，染色完毕，封片，光镜观察、照相。
2.3.3 免疫组化法 检测ER、PR的表达。按免疫组化试剂盒所示方法检测ER、PR定位、定量，包括标本的处理(脱水，浸蜡，包埋)、切片及贴片、脱蜡至水、染色、图像分析。以免疫组化SABC法检测ER、PR，具体操作按说明书进行，结果用计算机图像分析系统进行定位、定量，检测阳性细胞率(阳性细胞占视野中总细胞百分比)，测定平均灰度值。
2.3.4 图像分析 阳性区域着色呈棕黄色，阳性细胞区域用平均灰度值表示，灰度值越小，说明其阳性反应的程度越高，表达越强。切片于光镜下400倍放大，经显微摄像系统随机摄取5个视野，定位阳性区域在细胞表达的位置，通过图像分析系统检测阳性细胞率和平均灰度值。
3 统计学方法
所有数据均采用SPSS15.0统计软件包进行处理，计量资料以—(—资)±s表示，符合正态性和方差齐性的数据用单因素方差分析，样本间两两比较用q检验，不符合上述条件用秩和检验。
4 结果
4.1 妇科止血消痛颗粒对大鼠子宫形态学的影响
与空白组对照，宫腔内孕囊完全排出，250倍视野下观察到药物流产大鼠模型组上皮脱落坏死，内膜连续性中断，有少量炎性细胞浸润，内膜下小血管部分扩张、充血，间质较疏松水肿，造模成功。与模型组比较，妇科止血消痛颗粒低、中、高剂量组及产妇康组内膜上皮轻度损伤，内膜炎性细胞较少，偶可见小血管扩张、充血，间质较致密，炎性细胞少，内膜上皮损伤轻，宫腔中未见明显渗液。
4.2 妇科止血消痛颗粒对大鼠血清雌二醇、孕酮的影响(见表1)表1 妇科止血消痛颗粒对药物流产后大鼠E2、P的影响(—(—响)±s)注：与模型组比较，#P&<0.05，##P&<0.01;与产妇康组比较，*P&<0.05，
**P&<0.01(下同)
4.3 妇科止血消痛颗粒对大鼠子宫内膜组织雌激素受体、孕激素受体的影响(见表2)表2 各组大鼠子宫组织ER、PR表达的阳性细胞率、平均灰度值比较(—(—的)±s)
5 讨论
正常妊娠的维持有赖于垂体、卵巢和胎盘分泌的各种激素相互配合，其中P是维持早孕期蜕膜正常发育与机能的主要激素。药物流产利用米非司酮与PR相结合，使P不能发挥作用，因而蜕膜坏死出血。绒毛继发受损，内源性前列腺素产生增加，绒毛分泌的hCG减少，进而导致黄体溶解萎缩，功能减退，黄体产生的雌、孕激素下降，使蜕膜进一步剥离出血。流产后卵泡发育正常，分泌足够的雌、孕激素，是修复子宫内膜、恢复月经的必要条件。雌激素促使内膜增生，修复剥脱的子宫内膜创面，并能增加子宫对外界刺激，如催产素的敏感性。子宫内膜在E2、P的影响下发生周期性变化，而这种周期性变化的影响作用是通过ER、PR起作用的，即雌、孕激素是通过与靶细胞上的受体即雌、孕激素受体(ER、PR)结合而发挥作用。米非司酮和米索前列醇配伍作用后的蜕膜，ER和PR水平下降。
本实验结果显示，药物流产后大鼠血清中E2、P含量降低，大鼠子宫组织局部ER、PR存在异常低表达。妇科止血消痛颗粒能升高E2水平，降低P水平，升高ER、PR的低表达。妇科止血消痛颗粒系尤昭玲教授治疗气虚血瘀型产后恶露不绝及出血的临床经验方，能益气化瘀、扶正祛邪。可以推测，妇科止血消痛颗粒可能是通过以下途径发挥作用：①调整子宫内膜局部内分泌紊乱，提高血清雌激素水平，促使内膜增生，修复剥脱的子宫内膜创面;②增加子宫对前列腺素的敏感性，加强子宫肌的收缩，促进脱膜组织排出;③降低P水平，加速妊娠黄体的萎缩，减少孕激素对内膜的影响;④提高ER、PR水平，促进雌、孕激素与其受体结合，来治疗药物流产后子宫复旧不全。本方临床功效已被证实，本研究进一步从分子水平上为妇科止血消痛颗粒治疗药物流产后产后子宫复旧不全提供了有力依据。
参考文献
[1] 王晨红.米非司酮在引产中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志，2002， 18(5)：267.
[2] 张 凌，隆玉华，林 海.米索前列醇用于官腔镜手术100例临床观察[J].实用妇产科杂志，2005，21(12)：748.
[3] Neulen J， Williams RF， Breckwoldt M， et al. Non-competitive antioestrogenic actions of progesterone antagonists in primate endometrium：enhancement of estrogen and progesterone receptors with blockade of postreceptor proliferative mechanisms[J]. Hum Reprod，1996，11：1533-1537.
[4] 吴克明，龙 旭，曾 南，等.清宫止血颗粒对早孕大鼠子宫出口量与宫内膜形态的影响[J].成都中医药大学学报，2001，24(4)：24-41.
[5] 王月鹏，赵行宇，张慧锋.成年大鼠性周期阴道细胞变化探究[J].中国科技信息，2007(17)：192-193.