作者：刘真，魏运湘，于慧卿，马秀娟，王强，李武卫，李永新
【摘要】 目的 观察四妙勇安汤对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧损伤模型的影响。方法 实验分为3组，即正常组、模型组、四妙勇安汤组，后2组建立体外细胞缺氧模型，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察四妙勇安汤对缺氧内皮细胞存活率的影响，测定四妙勇安汤对缺氧内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响，并用免疫荧光法检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成量的表达。结果 四妙勇安汤能显著增加MTT实验中各孔吸光度值，降低LDH漏出量，增加VEGF的生成量。结论 四妙勇安汤具有保护缺氧的HUVEC损伤的作用，其作用机制与增加细胞活性、降低缺氧造成的细胞毒性、增加VEGF的表达、促进血管新生的作用有关。
【关键词】 四妙勇安汤;缺氧;人脐静脉内皮细胞;血管新生
Abstract：Objective To study the effect of Simiaoyongantang on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury induced by hypoxia. Methods The HUVECs were pided into normal group， model group and Simiaoyongantang group， and the hypoxia model was established at the latter two groups. The livability of HUVECs was measured by MTT assay. The transudation of LDH in the medium was measured by biochemistry and the positive expression of VEGF was detected by immunofuorescence chemistry. Results The level of LDH was reduced significantly and the cell activity indicated by MTT was increased. The number of the cells stained by VEGF increased in the treatment group of Simiaoyongantang. Conclution Simiaoyongantang has protective effect on hypoxia injured HUVECs， which may be related to its effect of increasing the cells livability， reducing the injury induced by hypoxia， up-regulating expressions of VEGF and promoting angiogenesis.
Key words：Simiaoyongantang;hypoxia;human umbilical vein endothelial cells;angiogenesis
自从Hockel等[1]提出了“治疗性血管生成”的概念后，以促血管生长因子诱导心脑血管组织新生血管形成，已成为治疗性血管新生研究中最为活跃的领域。组织缺血缺氧后首先受到影响的是内皮细胞，因此，对内皮细胞的研究成为了研究缺血缺氧性疾病的重要手段。人脐静脉为体外获得内皮细胞的重要来源，故选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验对象。现代药理研究表明，四妙勇安汤能够扩张血管，疏通及促进血液循环，使未闭塞的动脉及侧枝循环变粗、增多，已经广泛应用于治疗血栓闭塞性脉管炎。近年来研究表明，此方对心血管疾患疗效确切[2]。本实验从细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、血管内皮生长因子(VEGF)生成量3个方面观察了四妙勇安汤对缺氧HUVEC的影响。
1 实验材料
1.1 试剂
1640干粉(Gibco公司)，明胶(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，100 U/mL青霉素、80 ?g/mL链霉素(华北制药)，胰蛋白酶(Amersco公司)，四乙酸乙二胺-二钠(disodium edetate，EDTA)，Earle液(河北医科大学)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原(bs-0332R，北京博奥森生物公司)，VEGF(北京博奥森生物公司)，异硫氢酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记山羊抗兔多克隆IgG(ZF-0311，北京中杉金桥)，HUVEC (KG110，南京凯基生物公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Amersco公司)，二甲亚砜(DMSO，Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，华瑞创新生物公司)，LDH试剂盒(上海丰汇科技公司)。
1.2 主要仪器
CO2培养箱(Thermo)，倒置相差显微镜(Olympus)，荧光显微镜(Olympus)，微量振荡器(FU HUA ZW-A)，酶标仪(TECAN SUNRISE)，全自动生化仪(东芝120)。
2 实验方法
2.1 四妙勇安汤的制备
按原方准确称取每味中药(金银花90 g，玄参90 g，当归30 g，甘草15 g)，加入15倍的三蒸水(即1 g药加15 mL去离子水)急火煎煮1.5 h，16层纱布过滤，滤出药渣，隔水浓缩至原药材浓度为3 g/mL的药液，此时(60 ℃)药液相对密度为1.18 g/mL。冷却后用60%乙醇5～6 ℃沉淀24 h，倾去上清，水浴浓缩成稠膏。4 ℃保存备用。用时用培养液稀释成原药材浓度为64 ?g/mL的使用液。
2.2 内皮细胞缺血缺氧模型的建立
参考文献
[3]方法，HUVEC细胞株经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定为内皮细胞。将传代培养3～4代HUVEC细胞接种于6孔培养板中，孔底预先铺有明胶包被过的盖玻片，待融合成完整细胞单层后弃去原培养液，用无菌PBS缓冲液洗2次，加入Earle液3 mL，轻轻地将无菌石蜡油600 ?L滴入Earle液，使其完整覆盖于Earle液表面，将6孔培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。同时设未加石蜡油的标本为正常组。2.3 分组及处理
四妙勇安汤组：缺氧HUVEC中加入10%四妙勇安汤的1640细胞培养液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。模型组：缺氧HUVEC中加入正常1640培养液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。正常组：正常细胞加入正常1640培养液，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。每组均设置6个复孔。
2.4 MTT实验
细胞接种于96孔板中，参照上述缺氧模型及实验分组分别建立96孔板中缺氧模型及进行实验分组。每组均设8个复孔。将MTT配成终浓度为0.5 mg/mL的使用液。弃去96孔板中原培养液，各孔加入MTT使用液100 ?L，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1 h。取出培养板倒置，弃去原MTT，加入DMSO 100 ?L，微量振荡器振荡15 min。用酶标仪在测定波长492 nm、参考波长620 nm处测定各孔吸光度值[4]。
2.5 乳酸脱氢酶漏出量的检测
每组设6个复孔。按试剂盒说明，收集各组细胞培养液2 mL， 1 000 r/min离心3 min，提取上清液50 ?L，加入试剂盒自带试剂3 000 ?L，混匀后置37 ℃，分别于30、60 s时读取吸光度值。使用前用蒸馏水在340 nm处调零。
2.6 免疫荧光法测定血管内皮生长因子生成量
取出6孔板各孔中盖玻片，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min，10%福尔马林固定液室温固定10 min，PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min，10%马血清70 ?L室温封闭非特异性抗体20 min，加入一抗VEGF(兔抗人，1∶100稀释)70 ?L，37 ℃孵育1 h，同时以PBS代替一抗作为对照组。PBS轻轻冲洗3次，每次持续约1 min，加入FITC标记的二抗(羊抗兔IgG，1∶25稀释)70 ?L，37 ℃孵育30 min。立即置于荧光显微镜下观察，绿色荧光颗粒为阳性表达，于1×400目镜下取10个视野计数。
3 统计学方法
实验数据用—(—数)±s表示，数据均用统计学软件SAS6.12版进行统计学分析，多组间比较采用方差分析。
4 结果
(见表1～表3) 表1 四妙勇安汤醇沉药液对缺氧HUVEC活性的影响(—(—的)±s)注：与模型组比较△P&<0.01;与正常组比较，*P&<0.01(下同)表2 四妙勇安汤醇沉药液对缺氧HUVEC细胞毒性的影响(—(—毒)±s)表3 四妙勇安汤醇沉药液对缺氧HUVEC中VEGF生成量的影响(—(—量)±s)
5 讨论
缺氧可明显损害内皮细胞功能，缺氧细胞模型的建立有利于排除在体实验中众多的干扰因素，可以更加准确地了解缺氧后内皮细胞的功能变化及调控机制，较以往在体实验更加真实准确。采用HUVEC，较动物内皮细胞更符合人体生理特点，有利于进行人体缺氧后内皮细胞内生物活性物质变化与相应组织器官缺氧后病理改变关系和其作用机制的研究[3]。
四妙勇安汤首见于清·鲍相敖《验方新编》，为治疗脱疽的古方。现代临床常用于治疗热毒型血栓闭塞性脉管炎，或其他原因引起的血管栓塞病变。所有这些病变的基本病理基础为血栓闭塞引起局部组织血液供应发生障碍，产生急性或慢性的严重而持续的缺血缺氧甚至纤维化、坏死。四妙勇安汤具有清热解毒、活血止痛的功效，多年来，我们根据“异病同治”的治疗原则，将四妙勇安汤用于治疗缺血性心脏血管病变，取得较为满意的临床疗效。本实验采用中药醇沉方法，减少了异体血清由于不同种属对实验结果的影响。
MTT在一定的浓度下可被细胞摄取，并被线粒体脱氢酶氧化为蓝紫色甲臜颗粒，各孔颗粒产生量与活细胞数成正比，因此可用此实验检测细胞存活率[4]。模型组与正常组相比，细胞存活率明显降低。与模型组相比，加入四妙勇安汤醇沉药液后，细胞存活率明显升高，可以推测，四妙勇安汤可以通过减轻缺氧造成的细胞毒性，增加细胞存活率，有一定的抗缺氧作用。
缺氧时细胞膜通透性增加，无氧代谢增强，细胞内LDH升高并释放到细胞培养液中。模型组与正常组相比，LDH漏出量明显升高。与模型组相比，加入四妙勇安汤醇沉药液后，LDH漏出量明显降低，可以推测，四妙勇安汤可以明显减轻缺氧对内皮细胞的损伤，促进细胞有氧代谢，抑制无氧酵解及乳酸堆积来维持细胞膜的功能，有一定的膜保护作用，从而达到对内皮细胞的保护作用[5]。
VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原和活体血管新生诱导者，是调节血管新生的最重要的细胞因子之一，是有高度特异性的血管内皮细胞生长刺激因子，能特异性地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，促进侧支血管的形成，参与血管的新生[6]。因此，VEGF因其对内皮细胞作用的特异性而广泛应用于实验性肢体及心肌缺血的研究。本实验中，模型组与正常组相比，VEGF阳性表达数量明显较少。与模型组相比，加入四妙勇安汤醇沉药液后，VEGF阳性表达数量明显增多，因此可以推断，四妙勇安汤可以通过影响内皮细胞的内分泌功能，增加VEGF的生成，达到促血管新生的作用。
综上所述，四妙勇安汤能明显增加缺氧损伤的HUVEC存活率，降低其LDH漏出量，增加VEGF的生成，促进血管新生。其他作用机制还有待于进一步研究。
参考文献
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[6] 沈 伟，范维琥，施海明，等.红景天对兔主动脉粥样硬化斑块内血管内皮细胞生长因子表达及血管新生的影响[J].中国中西医结合杂志，2008， 28(11)：1022-1025.