作者：陶仕英，牛建昭，王继峰，赵丕文
【摘要】 目的 通过观察二仙汤及其组方中药对幼年大鼠肾上腺雌激素受体(ER)表达的影响，探讨其对肾上腺功能的影响机制。方法 幼年SD大鼠54只，分为正常对照、阳性对照、二仙汤、淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、黄柏和知母9组，各组给药6 d后麻醉大鼠，取血清测量睾酮的含量，分离摘取双侧肾上腺，称重后常规石蜡包埋切片，行免疫组织化学染色。结果 阳性对照组、二仙汤组肾上腺系数增加，二仙汤组、淫羊藿组、仙茅组和知母组血清睾酮水平降低，以二仙汤组最明显(P&<0.01)。ERα主要分布于肾上腺皮质球状带和束状带细胞的细胞质中，二仙汤组平均光密度值升高，而阳性对照组下降;ERβ主要分布于肾上腺皮质球状带和束状带细胞的细胞核中，二仙汤组、淫羊藿组、仙茅组和知母组平均光密度值与阳性对照组比较下降。结论 二仙汤及其方中温肾药(淫羊藿、仙茅)和滋阴药(知母)通过影响不同类型ER在肾上腺皮质中的分布发挥植物雌激素样作用，
【关键词】 二仙汤;肾上腺;雌激素受体;大鼠
Abstract：Objective To explore the possible functional mechanism of Er-xian Decoction and its component herbs on the expression of extrogen receptor (ER) in adrenal development rats. Methods Fifty-four development female SD rats were randomly pided into nine groups：normal control group (A)， positive control group (B)， Er-xian Decoction group (C)， Herba Epimedii group (D)， Rhizoma Curculiginis group (E)， Radix Morindae Officinalis group (F)， Radix Angelicae Sinensis group (G)， Cortex Phellodendri group (H)， Rhizoma Anemarrhenae group (I). After the rats were administrated for six days， serum were got to measure testosterone (T). Bilateral adrenal gland was weighed and embedded by paraffin. Mean optical density (MOD) were studied by the immunohistochemical method and image analyzing system. Results The adrenal coefficient was increased in group B and C， and the level of T was decreased in group C， D， E and I. ERα was mainly observed in the cytoplasm of zona glomerulosa and zona fasciculate. MOD in group C was increased while declined in group B. ERβ was mainly observed in nucleus of zona glomerulosa and zona fasciculate. MOD in group C， D， E and I was less than group B. Conclusion Er-xian Decoction and its component herbs of warming Shen (Herba Epimedii， Rhizoma Curculiginis) and nourishing Yin (Rhizoma Anemarrhenae) play a phytoestrogen role by influencing the expression of ERα and ER β in the adrenal cortex.
Key words：Er-xian Decoction;adrenal gland;estrogen receptor;rat
二仙汤是名医张伯讷教授20世纪中期创制的方剂，临床主要用于治疗围绝经综合征等肾阳虚所致病症，具有温补肾阳、改善体内雌激素分泌的作用[1]。体内产生雌激素的器官有卵巢、肾上腺和胎盘。因此，在绝经后的妇女中，虽然卵巢功能已衰退，但体内仍可检测到一定量的雌激素。已有研究表明，雌激素主要通过雌激素受体(ER)发挥作用，ER在不同组织分布、数量、种类不同[2]。本实验通过观察二仙汤及其组方中药对幼年大鼠肾上腺ER的影响，探讨二仙汤的植物雌激素样作用，为二仙汤应用于围绝经综合征的治疗提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SD雌性未成年正常大鼠54只，出生后21 d(刚断乳)，体重50～60 g，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK京(2007-0001)。实验期间饲喂在二级动物室，温度(25±1)℃。
1.2 药物
淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、黄柏、知母6味中药为免煎颗粒剂，首创大地药业有限公司生产。蒸馏水溶解，6味中药分别配制成原药材含量为0.1 g/mL药液;二仙汤按淫羊藿、仙茅、巴戟天∶当归、黄柏、知母为3∶2配制成原药材含量1 g/mL药液;阳性药物为己烯雌酚(批号20080104)，0.5 mg×100片/瓶，合肥久联制药有限公司生产。以上药物均购自北京中医药大学东直门医院。
1.3 试剂
一抗：ERα(MC-20)和ERβ(H-150)为Santa Cruz公司产品;过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(SP-9001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;血清睾酮(T)检测试剂盒购自北京华英生物技术研究所。
2 实验方法
2.1 分组与给药
将实验动物按体重均衡和随机的原则分为9组：正常对照组、阳性对照组、二仙汤组以及6个单味药组。实验动物适应性饲养3 d后开始实验。正常对照组给予等体积蒸馏水;阳性对照组按0.18 mg/(kg·d)给予己烯雌酚;二仙汤组按7.5 g/(kg·d)给药;淫羊藿、仙茅、巴戟天组按1.5 g/(kg·d)给药;当归、黄柏和知母组按1.0 g/(kg·d)给药。灌胃分早、晚2次进行，给药均持续6 d。
2.2 动物取材与血清提取
给药6 d，处死前禁食12 h。用10%水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉，沿大鼠腹正中线打开腹腔，自腹主动脉取血，经室温静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取其上清液，分别保存于EP管中，-20 ℃保存备用。将肾上腺与周围组织完全剥离后取出，称重，用中性甲醛固定后制成石蜡切片。
2.3 血清睾酮的测定
具体步骤参照所购试剂盒说明书。
2.4 免疫组织化学染色步骤
石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原10 min;入3%过氧化氢室温孵育30 min;正常山羊血清封闭液室温孵育20 min，倾去，分别用兔抗大鼠ERα或ERβ抗体(1∶150，Santa Cruz)孵育切片(4 ℃，过夜);羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30 min，DAB染色。每步骤间用0.O1 mol/L PBS充分洗涤，常规脱水，透明，封片，光镜下观察，摄片。染成棕黄色颗粒者为阳性。阴性对照采用PBS代替一抗孵育切片。
2.5 图像分析
采用通用医学图像分析仪，光镜下观察各组染色结果，用NIS-Elements Basic Research数据分析软件分析相应抗体的表达量，每组取6张切片，每张切片取5个视野，计算每视野阳性染色平均光密度值(Mean Optical Density，MOD)。
3 统计学方法
所有统计资料用—(—统)±s表示，统计学处理采用SPSS11.5软件，单因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 对大鼠肾上腺ERα、ERβ表达的影响
采用免疫组织化学法检测。ERα在各组大鼠的肾上腺皮质中均有表达，而在髓质中则未见表达，主要表达于肾上腺皮质的细胞质中，以球状带和束状带为主，呈深棕黄色颗粒状，网状带亦有表达，呈浅黄色颗粒状。ERβ主要表达于各组大鼠的肾上腺皮质的细胞核中，而在髓质中未见表达。以球状带和束状带为主，呈深棕黄色，网状带亦有表达，呈浅黄色。结果见表1。表1 各组大鼠肾上腺中ERα、ERβ的表达(—(—达)±s) 注：与阳性对照组比较，#P&<0.05，##P&<0.01;与正常对照组比较，
*P&<0.05，**P&<0.01(下同)
4.2 对肾上腺系数和血清睾酮的影响(见表2)表2 各组大鼠肾上腺系数和血清T含量比较(—(—肾)±s)
5 讨论
肾上腺是体内的一对重要的内分泌腺。在组织学上，肾上腺由周围的皮质和中央的髓质构成。皮质根据组成细胞的排列方式和功能的不同由外向内依次为球状带、束状带、网状带。网状带可分泌一定量的雄烯二酮，通过芳香化酶转化为雌酮，也可被17β-醇甾-脱氢酶转化成睾酮，睾酮再被芳香化成为雌二醇[3]。
本实验采用肾上腺系数而非肾上腺湿重，旨在消除大鼠体重因素产生的误差。结果发现：阳性对照组、二仙汤组肾上腺系数均增加。对血清T水平的影响，二仙汤组降低最明显，方中温肾药(淫羊藿、仙茅)和滋阴泻火药(知母)亦使T水平降低。因此，我们推测是否与植物雌激素的作用机制有关。雌激素是类固醇激素，透过细胞膜进入细胞内，与细胞质内ER上的配体结合区结合，并使受体二聚体化，结合后的复合物穿过核膜，在核内，ER上的DNA结合区与靶基因启动子上的雌激素应答元件结合，从而启动靶基因的转录，从而加速蛋白质的合成，使细胞增生[4]。在我们的研究中，应用免疫组织化学法发现ERα主要分布于肾上腺皮质球状带和束状带细胞的细胞质中，其中全方组表达量明显升高，因此，全方组肾上腺系数增加。而阳性组虽然ERα表达量明显下降，但其系数亦明显升高，可能是己烯雌酚发挥作用的途径与机制与植物雌激素不同，还需进一步研究。ERβ主要位于肾上腺皮质球状带和束状带细胞的细胞核，网状带亦有少量分布，这与薛氏等[5]研究结果相一致。与阳性对照组比较，全方组、淫羊藿组、仙茅组和知母组均降低，进一步推测己烯雌酚与植物雌激素作用机制的可能不一致。Kuiper GG等[6]研究表明，植物雌激素对ERβ的亲和力远高于ERα。另外，Brookes JD等[7]研究发现，植物雌激素作用于与合成雌激素相关的酶，如5α-二氢睾酮和3β-羟类固醇脱氢酶，从而影响体内激素的合成。因此，我们推测二仙汤及其组方中药淫羊藿、仙茅和知母可能通过影响这些酶的活性，从而使肾上腺皮质球状带分泌的睾酮进一步转化为雌激素，使血清睾酮含量下降。
参考文献
[1] 王续武.二仙汤加减治疗女性更年期综合征40例小结[J].甘肃中医， 2000，13(6)：41.
[2] Kuiper GG， Carlsson B， Grandien K， et al. Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta[J]. Endocrinology，1997，138(3)：863-870.
[3] 王淑贞.妇产科理论与实践[M].上海：上海科学技术出版社，1995.98.
[4] Morito K， Hirose T， Kinjo J， et al. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors alpha and beta(Ⅱ)[J]. Biol Pharm Bull，2002，25(1)：48-52.
[5] 薛晓鸥，师莉莉，牛建昭，等.卵巢切除对大鼠肾上腺雌激素受体亚型表达的影响[J].解剖学报，2008，39(2)：223-226.
[6] Kuiper GG， Lemmen JG， Carlsson B， et al. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta[J]. Endocrinology，1998，139(10)：4252-4263.
[7] Brookes JD， Thompson LU. Mammalian lignans and genistein decrease the activities of aromatase and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase in MCF-7 cells[J]. J Steroid Biochen Mol Biol，2005， 94(5)：461-467.