【摘要】 目的 通过观察川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注后梗死面积及缺血脑组织单克隆抗体(ED1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 表达的影响，探讨川芎嗪的作用机制。方法 将60只健康成年SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组及川芎嗪大、中、小剂量组，采用改良线拴法复制缺血再灌注脑梗死动物模型。川芎嗪大剂量组给予140 mg/kg川芎嗪静脉注射，中剂量组给予120 mg/kg静脉注射，小剂量组给予100 mg/kg静脉注射。实验结束后处死大鼠，从上述各组中取6只大鼠的脑组织取材制片、TTC染色、福尔马林固定后，采用病理图像分析系统，评价川芎嗪是否能减少脑梗死面积;将各组另6只大鼠断头取脑制片后，用免疫组化染色，观察ED1、IL-1β和TNF-α的阳性表达。结果 川芎嗪各治疗组可减少缺血90 min、再灌注24 h脑梗死面积，也可以减少脑梗死区域内的ED1、IL-1β和TNF-α的免疫阳性表达。结论 川芎嗪可以减少大鼠脑缺血再灌注后梗死面积，其治疗效用可能与抑制小胶质细胞活化和IL-1β、TNF-α的免疫阳性表达有关。
【关键词】 川芎嗪;脑缺血再灌注损伤;单克隆抗体;白细胞介素-1β;肿瘤坏死因子-α;大鼠
Abstract：Objective To investigate the effect of Tetramethyl Pyrazine (TMP) for treating cerebral infarct by observing infarct areas， and to research its function mechanism by observing the changes of the expressions of ED1， TNF-α and IL-1β in the infarction region after focal cerebral ischemia reperfusion injury. Methods Sixty SD male rats in healthy condition were randomly and averagely pided into normal group， model group and TMP high， middle and low dose group. The cerebral infarct animal model was reproduced by modified thread-tie method. TMP high dose group was administered TMP 140 mg/kg， middle dose group was 120 mg/kg and low dose group was 100 mg/kg by intravenous. Then all the rats were killed. Thirty rats were taken to evaluate whether TMP can decrease the ratio of cerebral infarction areas in the TTC-reacting and formalin fixation brain tissue slices taken from the above-mentioned killed rats， with Pathology Image Analysis System. The masculine of ED1， IL-1β and TNF-α in the immuno- reacting cells in cerebral infarction brain tissue slice taken from other thirty killed rats were observed. Results TMP groups decreased the ratio of cerebral infarction areas， and also decreased ED1， TNF-α and IL-1β in immuno-reacting cell. Conclusion TMP can decrease the formation of cerebral infarction caused by cerebral ischemia reperfusion and its effect is possibly related to the activation of microglia， as well as the immuno-positive expressions of TNF-α and IL-1β.
Key words：Tetramethyl Pyrazine;cerebral ischemia reperfusion;ED1;interleukin-1β;tumor necrosis factor-α;rat
脑缺血再灌注损伤的发生机制是一个多因素相互作用、相互影响的病理生理过程，除了缺血本身，由缺血导致的血液流变学紊乱、凝血机制障碍以及白细胞浸润引起的炎症反应等均参加了组织损伤，尤其再灌注后会加重炎症反应，通过脂质过氧化作用、细胞免疫反应、小胶质细胞的活化及炎症细胞免疫反应产生的白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等都会造成梗死核心区周边区域神经细胞的损伤程度加重，梗死范围扩大。国外有关此类研究的动物实验也证明了小胶质细胞活化和浸润的白细胞表面都有单克隆抗体(ED1)的表达，而IL-1β和TNF-α也是强有力的细胞因子，它们可通过一系列促炎症反应对缺血性脑组织进一步损害[1-2]。业已证实，抗炎治疗可以减轻缺血再灌注所致的神经损伤。作为川芎主要活性成分的川芎嗪对脑缺血再灌注损伤的保护作用已有文献报道[3]。本实验拟通过建立大鼠大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注动物模型，采用TTC染色方法观察不同剂量川芎嗪给药后脑缺血再灌注梗死面积的变化，并应用免疫组化染色观察缺血脑组织中的ED1、IL-1β和TNF-α的表达，探讨川芎嗪对脑缺血再灌注损伤的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康清洁级成年Sprague-Dawely(SD)雄性大鼠60只，体重(325±25)g，标准饲料和清洁自来水适应性喂养1周，动物和饲料均由首都医科大学实验动物部提供。
1.2 药物
川芎嗪购自哈尔滨三联药业，于实验前新鲜配置，根据大鼠体重称取所需药量。配制方法如下：将川芎嗪溶解，然后加入磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)：如300 g大鼠即称30 mg川芎嗪(100 mg/kg)，加入100 ?L溶媒中溶解，再加入2.9 mL PBS配成10 mg/mL川芎嗪溶液。配好后保存于4 ℃冰箱备用。
1.3 试剂
水合氯醛(上海美季生物技术有限公司，批号A44310500);肝素钠(江苏常州千红生化制药厂，批号071121);溶媒(山西恒大制药有限公司，批号h30057466);蔗糖(德国普博克公司产品);TTC(四氮唑红，美国Sigma公司产品);多聚甲醛(美国Sigma公司产品);ED1、IL-1β和TNF-α抗体和即用型(SP)免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司产品)。
1.4 主要仪器
上海上皿电子天平(FA1104);病理图像分析仪(北京航空航天大学图像中心制造);恒温箱(DHP-9002型，上海益恒实验仪器有限公司);包埋机(EG 1150H，上海Leica公司);冷冻切片机(英国cryostat公司);精密光学显微镜(日本OLYMPUS)。
2 实验方法
2.1 分组、造模及给药
将实验用SD大鼠随机分为假手术组、模型组及川芎嗪大、中、小剂量组，每组12只。大鼠于实验前10 h开始禁食禁水，川芎嗪大、中、小剂量组分别于缺血前10 min静脉注射川芎嗪140、120、100 mg/kg，然后以4%的水合氯醛(4 mg/kg)腹腔注射，麻醉后，仰卧位固定在手术台上，腹侧颈部及左、右侧鼠蹊部备皮，常规消毒，采用颈部正中切口，暴露气管，在其右侧寻得颈总动脉，钝性分离出右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，除假手术组仅暴露上述动脉外，其他实验大鼠均结扎并剪断颈外动脉，分离颈总动脉分叉部，夹闭右侧颈总动脉和颈内动脉。将线栓(头端加热成光滑球形的8-0尼龙线)自颈外动脉的残端插入，将线导入颈内动脉，松开颈内动脉夹，继续将尼龙线插入其颅内段，当感到有明显阻力时，即达到较细大脑前动脉，阻断了大脑中动脉的所有血液供应，此时栓线插入深度为(18.5±1.0)mm(自颈动脉分叉处算起)，90 min后需要再灌注时，轻轻提拉所留线头，至有阻力时表示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，将线抽出，结扎颈外动脉残端，松开颈总动脉夹即可。
2.2 指标检测
2.2.1 脑梗死面积的测定 假手术组仅手术暴露出右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，不阻断血流，90 min后缝合切口，经24 h后断头取脑。模型组及其他各组大鼠在按要求完成给药及手术后，阻断血流90 min，再灌注24 h后，迅速断头取脑。每组取6只大鼠取脑后，放置于脑切塑料模型中自额极向枕极进行冠切，每片厚度2 mm，共切6片，然后将脑组织冠切片置于2%TTC磷酸缓冲液的12-well染色盘中染色，恒温37 ℃避光孵育30 min，最后将脑切片放入10%的中性缓冲福尔马林液中固定。将已固定的脑组织切片置于滤纸上，吸干表面液体，采用病理图像分析仪的软件分析系统计算每张冠切片的脑梗死面积，并以6张冠切片的脑梗死面积总和除以6，求其均值用于统计分析。
2.2.2 免疫阳性细胞计数 将上述各组中另6只大鼠断头取脑后，置入4%的多聚甲醛试管内，4 ℃下静置3 d，待固定完全后将多聚甲醛倒除，换装30%蔗糖4 ℃下静置4 d，待鼠脑沉入试管底脱水完成后取出鼠脑，放入脑切盒。以前述方法冠切6片，选择从前额叶算起脑冠切片的第2片至第4片区间的组织，将其置入组织冰冻包埋剂中包埋，再放置于-80 ℃冰箱中贮存，将冰存之大鼠脑包埋组织取出，至-20 ℃冷冻切片机，以20 ?m的厚度进行冠切，并将切得的冠切片平铺于gelatin coated (挂胶)的玻片上，选取前囟门后0.92 mm、大脑正中线旁8.08 mm处之脑冠切玻片准备ED1、IL-1β和TNF-α免疫组化染色。将脑组织ED1、IL-1β和TNF-α免疫组化染色后的切片，采用病理图像分析仪，固定面积(1 mm2)观察并进行免疫阳性细胞计数。显微镜下观察到胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。每张切片中采集10个具有代表性的高倍视野(400×)，其中大脑皮层5个，基底节区5个，每个视野中细胞总数不少于100个，尔后计算阳性细胞总数，再求出均值。
3 统计学方法
数据均以—(—均)±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。两均值之间比较用t检验，多组间结果比较用方差分析，以ɑ=0.05为检验水准。
4 结果
4.1 各组相对梗死面积的比较
4.1.1 肉眼观察结果 假手术组脑组织呈深红色，表明无梗死灶;模型组和川芎嗪大、中、小剂量组右半脑的皮质区呈现苍白色坏死组织区，即梗死损伤灶。
4.1.2 各组大鼠脑梗死面积比较(见表1)表1 各组大鼠脑梗死面积比较(—(—面)±s) 注：与假手术组比较，▲P&<0.05;与模型组比较，●P&<0.05(下同)
4.2 各组大鼠脑组织ED1、IL-1β和TNF-α表达比较(见表2) 表2 各组大鼠ED1、IL-1β和TNF-α染色的免疫阳性细胞数比较
5 讨论
大量研究表明，川芎嗪具有抑制血小板聚集、舒张血管、增加血流及通过抑制氧自由基的形成达到抗氧化的作用，并有降低钙离子超载及抗炎症反应的效果[4]。Liao等[5]将川芎嗪用于大鼠脑缺血再灌注72 h动物模型，发现其可以减少大鼠脑梗死面积形成，减轻缺血脑损伤。Zhao等[6]发现川芎嗪参与了抗炎症反应的过程，从而减少了神经细胞的损害。本实验发现，川芎嗪能明显减少脑缺血再灌注后的梗死面积，提示该药具有脑保护作用。本实验依据预实验中各治疗组梗死面积与模型组梗死面积比较所显示的结果，以川芎嗪100 mg/kg为减少梗死面积形成的有效剂量，并在实验中以100、120、140 mg/kg为不同剂量治疗组进行研究，结果显示，各治疗组均可有效减少大鼠缺血再灌注损伤的脑梗死面积，但是上述不同剂量组间并不具有统计学意义，随着川芎嗪剂量的增加并没有增加减少大鼠脑梗死面积的效用，即川芎嗪对于大鼠缺血再灌注损伤的治疗效用并非为剂量依赖型。
脑缺血再灌注后损伤是十分复杂的病理生理过程。国内外大量研究表明，细胞因子诱导的炎症反应是主要原因之一[7-8]。脑部发生缺血再灌注损伤时，周围血液中的嗜中性粒细胞和吞噬白细胞聚集在损伤区域，经滚动、附着进入梗塞区域行吞噬作用。周边血液中嗜中性粒细胞和吞噬白细胞经微循环粘附、聚集于大脑血管内皮上，会加剧脑细胞缺血，因而使梗死面积逐渐扩大，导致第二次的神经损伤;周边血液中的嗜中性粒细胞和吞噬白细胞所释出的IL-6、IL-8将小胶质细胞活化成阿米巴样，最后形成具吞噬能力的活化的小胶质细胞，并且释放IL-1β、TNF-α，加剧脑缺血区的损伤。已有研究表明，IL-1β表达与急、慢性神经损伤有关，TNF-α的生物活性与IL-1β非常相似，其可以促进趋化性物质释放，并增加内皮细胞粘附因子的表现，同时也会增加IL-6产生;IL-6可以加剧中性粒细胞被吸引至损伤部位，并改变内皮细胞的通透性[9]。本研究中ED1免疫组化染色显示：缺血90 min、再灌注24 h后，假手术组免疫阳性细胞表达最少，模型组免疫阳性细胞显著表达，依据结果推论，缺血再灌注脑损伤的机制与小胶质细胞活化具有相关性。脑缺血再灌注时，胶质细胞及小胶质细胞活化同时亦会产生IL-1β、TNF-α;IL-1β、TNF-α可以诱发磷酸二酯酶A和环氧化酶的表现[10]，亦可以使IκB磷酸化，并表现与炎症反应有关的基因并制造其下游蛋白质加剧细胞损伤[11]。本研究IL-1β、TNF-α免疫组化染色结果显示：假手术组免疫阳性细胞表达最少，模型组显著表达，川芎嗪大、中、小剂量组可明显降低脑缺血组织ED1、IL-1β和TNF-α的表达，提示其脑保护机制可能是通过抑制缺血区的炎症反应实现的。
参考文献
[1] 沈映君，徐秋萍，陈 奇，等.中药药理学[M].北京：人民卫生出版社，2000. 629-641.
[2] Benavente O， Hart RG. Stroke. part Ⅱ：management of acute ischemic stroke[J]. Am Fam Physician，1999，59(2)：2228-2234.
[3] 黄建邦，刘雪芬，陈树元.川芎嗪对人血多形核白细胞呼吸暴发与氧自由基的抑制作用[J].中国西医结合">中西医结合杂志，1994，14(10)：607-609.
[4] Garcia JH， Yoshide Y， Chen H， et al. Progression from ischemic injury to infarct following middle cerebral artery occlusion in the rat[J]. Am Pathol，1993，50(142)：623-635.
[5] Liao SL， Kao TK， Chen WY， et al. Tetramethylpyrazine reduces ischemic brain injury in rats[J]. Neurosci Lett，2004，372：40-45.
[6] Zhao H， Zhuang F， Stoltz JF， et al. Comparative studies of LFA-1 ICAM-1 interaction by micropipette and flow chamber technique[J]. Biorheology，2003，40(2)：179-187.
[7] Berti R， Williams AJ， Moffett JR， et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury[J]. Cereb Blood Flow Metab， 2002，22：1068-1079.
[8] Chen JL， Sanberg PR， Li Y， et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke，2001，32(11)：2682-2688.
[9] 苏志强，刘亢丁，饶明俐.缺血半影区[J].中风与神经疾病杂志，1995， 12(5)：316-318.
[10] Pettigrew LC， Kindy MS， Scheff S， et al. Focal cerebral ischemia inthe TNF-alpha-transgenic rat[J]. Neuroinflammation，2008，23：5(1)：47.
[11] 李 浩，毕桂南，罗传铭.鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应及环磷酰胺影响[J].中风与神经疾病杂志，2006，23(5)：541-544.