作者：马勇，张允申，陈金飞，喻斌，许建安
【摘要】 目的 研究活血通络汤对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧/复氧损伤CD54表达及中性粒细胞(PMN)粘附率的影响。方法 制备兔含药血清;HUVEC复苏和培养后，建立缺氧/复氧损伤模型;将模型细胞分为5组，即正常对照组、模型组及活血通络汤高、中、低剂量组。上述分组处理后，倒置显微镜下观察其形态学变化，测定CD54表达及PMN粘附率。结果 活血通络汤低、中、高剂量组能够抑制HUVEC CD54表达、降低PMN与HUVEC的粘附率，且作用呈剂量依赖性改变，其中活血通络汤中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。结论 活血通络汤能够抑制CD54的表达增多、改善血管内皮细胞在缺氧条件下的细胞粘附性，从而对血管内皮细胞起到保护作用，这可能是该方防治下肢深静脉血栓的作用机制之一。
【关键词】 活血通络汤;缺氧/复氧;血管内皮细胞;CD54;中性粒细胞;粘附率
Abstract：Objective To investigate the effect of Huoxuetongluo Decoction on expression of CD54 and polymorphonuclear adhesion during human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) anoxia/ reoxygenation injury， and explore its possible mechanisms. Methods Rabbits serum containing Huoxuetongluo Decoction was prepared. Resuscitate and culture HUVEC， then establish the anoxia/ reoxygenation injury model of HUVEC. The model cells were pided into five groups：normal control， model group and group of high， medium， low dose of Huoxuetongluo Decoction. After dealt seperately， the morphologic change of cells were observed through the microscope， the expression of CD54 and the polymorphonuclear adhesion were determined. Results The group of low， medium and high dose of Huoxuetongluo Decoction inhibited the expression of CD54 and decreased the adhesion between polymorphonuclear and HUVEC， the effects were strengthened with increasing the dose of Huoxuetongluo Decoction. The difference between group of medium， high dose of Huoxuetongluo Decoction and model group had statistical significance (P&<0.05). Conclusion Huoxuetongluo Decoction can control the expression of CD54， decrease the adhesion of vascular endothelial cell (VEC) under the circumstance of anoxia， consequently， the decoction can protect VEC from the damage. These maybe one of the mechanisms that the decoction has effect in the treatment of deep venous thrombosis of lower extremity.
Key words：Huoxuetongluo Decoction;anoxia/reoxygenation;vascular endothelial cell;CD54;polymorphonuclear;adhesion
人工髋关节置换术后下肢深静脉血栓形成的防治已倍受人们关注，文献报道显示，未行任何预防措施的髋关节置换术后下肢深静脉血栓发生率约50%，而肺栓塞发生率为2%～3%，后者是髋关节置换患者中术后早期死亡的原因之一[1-2]。因而，探讨其预防及治疗有着重要意义。血管内皮细胞(vascular endothelial cell， VEC)不仅是血流和血管壁之间的机械屏障，而且是高度活化的、功能异常活跃的内分泌、旁分泌及代谢器官，多种理化因素可导致内皮细胞功能障碍，成为血管性疾病产生的关键环节[3]。因此，保护VEC免受有害因素的损伤，维护其正常功能，对防治下肢深静脉血栓具有重要的意义。笔者以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象，观察活血通络汤对HUVEC缺氧/复氧损伤CD54表达及中性粒细胞(PMN)粘附率的影响，旨在阐明活血通络汤在临床治疗血管相关疾病的实验基础及初步机制，为防治下肢深静脉血栓提供理论依据。
1 实验材料
1.1 药物及试剂
活血通络汤(薏苡仁20 g，苍白术、茯苓、泽兰、泽泻、牡丹皮、丹参各10 g，牛膝、鸡血藤各15 g，地龙6 g，蜈蚣3 g，淫羊藿、骨碎补、鹿含草各15 g，传统水煎、冷藏保存，备用)，由江苏省中医院骨伤科提供;RPMI Medium 1640(美国Gibco公司);新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司，批号070915);胰蛋白酶(1∶250，Amresco分装);Rabbit Anti CD54(ICAM-1，武汉博士德生物工程有限公司);SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);Percoll(南京生兴生物有限公司)。
1.2 仪器
莱卡显微镜工作站(德国莱卡公司);Forma细胞培养箱(Forma公司);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司);超净工作台(苏州净化设备厂);Beckman冷冻台式离心机(美国Beckman公司);精密移液器(吉尔森公司)。
1.3 动物
大耳白家兔8只，雌雄各半，体重2.0～2.5 kg，南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物合格证号：SCXK(苏)2007-0008。
1.4 实验细胞
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
2 实验方法
2.1 脐静脉内皮细胞复苏和培养
冻存的HUVEC细胞37 ℃温水中解冻，吸出细胞悬液置于离心管中，加入含10%新生牛血清的RPMI1640培养液，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，RPMI1640培养液重新悬浮细胞，倒置显微镜下计数，将HUVEC按1×104 cell/mL的密度接种于预先铺有玻片(5 mm×5 mm)、直径为35 mm的培养皿中，每个培养皿中4块玻片。37 ℃、95%O2、5%CO2条件下培养，待细胞长至80%融合后，弃去上清，以含0.5%血清的RPMI1640培养液培养24 h，使其同步化生长，即可用于实验。
2.2 脐静脉内皮细胞缺氧/复氧模型的建立
HUVEC同步化生长后，换用无血清的1640培养液，将培养皿置于一密闭的干燥器内，利用烛光将干燥器内的氧气耗尽，以造成低氧环境并维持24 h，24 h后取出培养皿并立即转入37 ℃、95%O2、5%CO2条件下继续培养8 h。
2.3 含药血清的制备
家兔连续灌胃活血通络汤4 d，每日2次，剂量为10 g/kg，最后1次灌胃30 min后颈动脉放血，2 000 r/min离心10 min得血清。将血清原液、2倍稀释液和4倍稀释液分别作为高、中、低3个剂量组的药液。
2.4 分组及处理
实验共分5组。正常对照组：加入无血清的RPMI1640培养液3 mL，正常条件下培养32 h;模型组：加入无血清的RPMI1640培养液3 mL，缺氧24 h，复氧8 h;活血通络汤高剂量组：加入含药血清原液;活血通络汤中剂量组：加入含药血清2倍稀释液;活血通络汤低剂量组：加入含药血清4倍稀释液。活血通络汤各组分别预孵1 h后，缺氧24 h，复氧8 h。
2.5 观察指标
2.5.1 形态学观察 各实验组细胞处理32 h后，于相差倒置显微镜下观察其形态学变化。
2.5.2 CD54表达测定 采用SABC免疫组化染色方法检测。取出准备及固定好的细胞，用PBS润洗1 min，浸入30% h3O2 1份+纯甲醇50份混合液，37 ℃孵育30 min，以灭活内源性过氧化物酶;滴加Rabbit Anti CD54抗体，稀释度为1∶100，4 ℃过夜;滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37 ℃、60 min;加ABC复合剂，湿盒中37 ℃、20 min;DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。阴性对照除了用PBS替代Rabbit Anti CD54抗体外，其余步骤同上。每张切片在统一放大倍数10×20下随机选取10个视野，计算平均单个视野CD54阳性细胞数(CD54阳性细胞染色为细胞膜染色)。
2.5.3 中性粒细胞粘附率 加5 mL72% Percoll于离心管中，然后将等体积的63% Percoll加在之上，取肝素抗凝血5 mL，加在63% Percoll之上，1 500 r/min离心30 min，微量吸管吸出离心管中间PMN层，加入等体积的双蒸水溶胀混入的红细胞，1 000 r/min离心10 min，至无RBC，将分离所得的PMN用无血清的RPMI 1640培养液混悬，调整浓度为5×108 cells/L，备用。各实验组HUVEC细胞PBS洗涤2次，加入1 mL的PMN悬液(其中含有5×105个 PMN)，于培养箱内继续培养，1 h后吸出上清，用1 mL PBS轻洗1次，将上清和PBS洗液合并，用细胞计数板计数未粘附的PMN数量。
粘附率(%)=
5×105-收集PMN数
×100%
5×105
3 统计学方法
应用SPSS12.0软件，计量资料以—(—资)±s表示，采用方差分析，组间两两比较。
4 结果
4.1 脐静脉内皮细胞形态变化
倒置相差显微镜下观察：正常组细胞生长状态良好，贴壁较牢，细胞间连接紧密;细胞呈多角型或短梭形，边界清楚，大小均匀，呈单层铺路石样排列。模型组细胞收缩、变圆，胞体变小，细胞间隙增宽，细胞边界不清，部分胞膜不完整，甚至损伤破裂，有较多细胞脱落。活血通络汤高、中、低剂量组，细胞形态虽与正常组有所差别，但已有所改善，细胞间隙较损伤模型组缩小，细胞间连接增加，边界较清楚。
4.2 对脐静脉内皮细胞CD54表达的影响(见表1)表1 活血通络汤对缺氧/复氧诱导HUVEC CD54的表达的影响(—(—V)±s)注：与模型组比较，*P&<0.05(下同)
4.3 对中性粒细胞粘附率的影响(见表2)表2 活血通络汤对PMN粘附率的影响(—(—率)±s)
5 讨论
研究表明，缺血再灌注损伤(I/R)的病理生理过程属于炎症反应[3-4]，其中PMN的参与是导致损伤的关键因素，而血管内皮则是关键部位。血管内皮处于血液循环和间质组织之间，是各组织缺血及再灌注过程中最先波及的部位，该部位的变化又对各组织、器官的损伤或功能恢复影响巨大[5]。目前大量研究认为，VEC的损伤和凋亡不仅使其丧失机械屏障，而且释放大量炎性因子、凝血因子，并激活血小板、诱发血管痉挛和血栓形成。
VEC被激活后，细胞膜表面出现一些激活抗原，并可表达多种细胞粘附分子。CD54是活化的VEC表达的重要粘附分子，其与CD11a/CD18相结合，介导淋巴细胞和白细胞与VEC的粘附作用，可引起血管内皮损伤，导致微血管闭塞。正常VEC仅微量表达CD54，而在缺氧损伤后CD54表达增多，VEC粘附特性改变。正常情况下，VEC与PMN不粘附或很少粘附，即使偶尔粘附也会很快分开[6]，而在缺血再灌注的情况下，VEC及PMN表面粘附分子的数量或结构发生改变，使PMN牢固粘附于血管内皮表面[7-8]。PMN与VEC粘附结合后，将形成一个较紧密且相对稳定的微环境，有利于PMN释放的毒性介质在局部保持较高浓度，从而对VEC发挥持续有效的毒性损伤作用[9]。
本实验结果表明，活血通络汤能充分抑制缺氧/复氧HUVEC CD54表达的增多，显著降低PMN与HUVEC粘附率。而目前的药理学研究也表明，活血通络汤组方中丹参提取物丹参酮能抑制兔内毒素血症模型PMN与VEC粘附的作用，保护VEC，其机制与降低肿瘤坏死因子(TNF-α)水平及抑制粘附因子CD11a/CD18、CD11b/CD18的表达有关[10]。李氏等[11]通过实验认为血瘀模型的大鼠具有高度重复性的VEC数增加，与全血粘度、纤维蛋白原和血细胞比容增加相并行，服水蛭后，VEC数明显减少且血液流变学指标得到改善。司氏等[12]认为，蜈蚣可通过调节一氧化氮/内皮素平衡，抑制VEGF的表达，防止内皮细胞的增殖，提示蜈蚣具有保护VEC功能。
各种损伤因素导致的微循环障碍，使组织、细胞缺氧，是许多临床疾病尤其是血管性疾病发生与发展的重要改变之一。我们通过前期实验，已证实，活血通络汤能够通过改善微循环、血液流变学指标、抗血小板聚集及血栓形成等作用防治下肢深静脉血栓。本次实验表明，活血通络汤通过抑制CD54的表达、改善VEC在缺氧条件下的细胞粘附性，避免PMN释放的毒性介质对VEC产生的损伤，进而抑制VEC释放凝血因子、激活血小板、诱发血管痉挛和血栓形成等作用的发生，推测这可能是活血通络汤防治下肢深静脉血栓的又一作用机制。然而，有关活血通络汤抑制PMN与VEC粘附的具体机制有待进一步深入研究。
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