作者：宋平顺，杨树声，马真金，郭永福
【摘要】 目的 以甘肃丹参中脂溶性成分、水溶性成分为指标，通过正交试验探讨酒制甘肃丹参的炮制工艺。方法 采用高效液相色谱法，以脂溶性成分、水溶性成分含量为指标，通过正交设计筛选炮制工艺。结果 水提取对脂溶性成分转移率仅为2.4%，实际意义不大;而对水溶性成分丹酚酸B含量有显著影响，最佳工艺条件为10%的黄酒，加20%的酒量，在80 ℃炒炙4 min。结论 选择最佳炮制工艺对于酒制甘肃丹参的制备较为合理。
【关键词】 甘肃丹参;炮制工艺;正交试验;丹酚酸B;高效液相色谱法
Abstract：Objective With fat-soluble ingredients and water-soluble components as indicators， to investigate the processing technology of wine Gansu Salvia by orthogonal test. Method With fat-soluble ingredients and water-soluble components determined by HPLC， the processing technology of wine Gansu Salvia was optimized by orthogonal test. Result The transfer rate of fat-soluble ingredients with water extraction was 2.4%， with little significance， while it had a significant impact on salvianolic acid B. The best process condition was 10% yellow rice wine， added 20% wine， fried in 80 ℃ for 4 min. Conclusion It was reasonable to choose the best process condition for wine Gansu Salvia.
Key words：Gansu Salvia;processing technology;orthogonal test;Salvianolic acid;HPLC
甘肃地产丹参药材商品习称“甘肃丹参”，来源于唇形科鼠尾草属植物甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim.、褐毛甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim.var.mandarinorum (Diels) Stibal的根及根茎[1]，作为丹参代用品，应用历史悠久[2]。目前，甘肃丹参酒制法多为经验操作，选择的辅料、用量、火候等缺乏规范的工艺参数，导致饮片质量不易控制。本研究以脂溶性成分、水溶性成分的含量为指标，采用正交试验设计，探讨酒制甘肃丹参的最佳炮制工艺;并且依据其变化对有关炮制方法和炮制机理进行探讨，为酒制甘肃丹参生产工艺及临床疗效提供依据。
1 仪器与试药
美国Waters高效液相色谱仪(515型泵，717自动进样器，2487型紫外检测器)。METFIJER AE240电子天平;超声波清洗器KQ2500(昆山市超声仪器有限公司)。DGB/20-002台式干燥箱(重庆试验设备厂制造);电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);水浴锅(河南巩义市英峪予华仪器厂);美的牌电磁炉(美的集团)。
丹参酮ⅡA(批号110766-200417)、丹参酮Ⅰ(批号0867- 200003)、二氢丹参酮(批号868-200002)、隐丹参酮(批号852- 9903)、丹酚酸B(批号111562-200504)均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。甲醇、乙腈为色谱纯;水为纯净水;其余试剂为分析纯。辅料黄酒(酒精度分别≥5%、≥10%，浙江绍兴酒厂)、白酒(酒精度≥42%，甘肃省条山酒厂)。甘西鼠尾草Salvia Przewalskii Maxim.的根茎，野生品自采于岷县，经笔者严格鉴定。
2 方法与结果
2.1 脂溶性成分含量测定[3]
2.1.1 色谱条件 大连伊利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 ?m)。流动相：甲醇-水(80∶20);流速：1.0 mL/min;检测波长：270 nm;进样量：10 ?L;柱温：室温。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2 000。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取8.44 mg丹参酮ⅡA、5.17 mg丹参酮Ⅰ、5.58 mg二氢丹参酮和4.10 mg隐丹参酮对照品，分别置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇定容制成对照品储备溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定甘肃丹参(过3号筛) 0.3 g，置具塞三角烧瓶中，精密加甲醇50 mL，称重，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)40 min，放冷，用甲醇补充减失的重量，摇匀。
2.2 水溶性成分含量测定[4]
2.2.1 色谱条件 大连伊利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 ?m)。流动相：甲醇-冰醋酸-水(20∶80∶1)。二元梯度洗脱：0 min→5 min，甲醇10%;5 min→25 min，甲醇10%→35%;25 min→45 min，甲醇35%。流速：1.0 mL/min;检测波长：280 nm;进样量：10 ?L;柱温：45 ℃。理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于4 000。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品8.25 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容制成对照品储备溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 取甘肃丹参样品(过3号筛)0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加水50 mL，称定重量，90 ℃水浴回流90 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 酒制甘肃丹参饮片的制备
取原药材，除去杂质，洗净，每隔1 h均匀洒1次水，并翻匀，共洒水4～6次，使药材软化，稍晾，切薄片，晾干，即得甘肃丹参饮片。
称取甘肃丹参饮片共9份，每份20 g，分别置于9个容器中，按L9(34)正交表安排的9种工艺，加入相应量的辅料，拌匀，闷润2 h，置于电磁炉上的锅中，用相应温度炒至规定的时间(电磁炉控温和定时)，晾干，置干燥容器内，备用。另取5 g饮片粉碎成粗粉，测得水分。
称取酒制甘肃丹参饮片10 g，置具塞三角烧瓶中，加水40 mL，闷润20 min，置煤气炉加热至沸，文火保持沸腾10 min，取下，过滤;滤渣加水20 mL，置煤气炉加热至沸，文火保持沸腾10 min，取下，过滤;合并两次滤液，定容至50 mL，摇匀，即得酒制甘肃丹参饮片溶液。
2.4 炮制工艺的优选与结果分析
2.4.1 正交试验设计 参照全国炮制规范中酒制方法和实际经验，选取影响较大的因素，采用正交试验法进行工艺优选。选取酒的种类(A)、酒的用量(B)、炒炙温度(C)、炒炙时间(D)，分别设3个水平，不考虑交互作用，选用L9(34)正交表安排试验，因素水平见表1。表1 正交试验因素水平表
2.4.2 试验方法 按酒制甘肃丹参样品的方法制备饮片，再按L9(34)正交表安排的9种工艺进行试验，每份试验重复2次，然后，取饮片按酒制甘肃丹参饮片溶液的制备方法，滤液分别测定脂溶性成分、水溶性成分含量及转移率。
2.4.3 脂溶性成分正交试验结果及分析 测定丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮和隐丹参酮4种成分的总量(?g/g)，正交试验测定数据和统计结果见表2。
由于水提取对脂溶性成分转移率很低，实际意义不大。含量极差分析认为，各因素的主次顺序是A&>B&>C&>D;方差分析4因素的水平变化对总丹参酮转移率均没有显著影响(P&>O.05)。
2.4.4 水溶性成分正交试验结果及分析 测定丹酚酸B含量，正交试验测定数据和统计结果见表3，方差分析见表4。
含量极差分析认为，各因素的主次顺序是A&>B&>C&>D，即酒种类&>酒的用量(%)&>炒炙温度&>炒炙时间(min)，最佳的工艺条件定为A2B2C1D2，即10%的黄酒，加20%的酒量，在80 ℃炒炙4 min。
方差分析认为，因素A对结果有显著影响(P&<0.05)，因此，将酒的浓度确定为10%的黄酒是必要的;而B、C和D对结果无显著影响，可任取一水平进行搭配。表2 脂溶性成分L9(34)正交试验结果注：转移率是炮制后与炮制前4种成分在提取液中总量的比率表3 水溶性成分L9(34)正交试验结果注：转移率是炮制后与炮制前丹酚酸B成分在提取液中总量的比率表4 水溶性成分正交试验方差分析表
从表2与表3可以看出，水溶性成分的提取率显著高于脂溶性成分，因此，甘肃丹参以饮片水煎入药时，对脂溶性成分可以忽略不计，亦不采用加权平均法计算其综合评分，直接以水溶性成分的最佳的工艺条件定为A2B2C1D2，即10%的黄酒，加20%的酒量，在80 ℃炒炙4 min，作为提取工艺研究的考察指标。
2.4.5 验证试验 2次最佳工艺验证结果分别为18.01、17.85 mg/g，丹酚酸B成分含量高于试验组，说明所选工艺条件A2B2C1D2是最佳工艺。
3 讨论
3.1 指标的选择与最佳工艺
甘肃丹参中的脂溶性成分、水溶性成分是与其药效作用密切相关的重要活性物质，在进行正交试验时，笔者以两类成分作为考察酒制工艺的指标;为了使考察的结果更为贴近实际，我们采用传统的用药方法即饮片煎煮。由于脂溶性成分的煎出率非常低，实际意义不大而忽略。关于炮制品的最佳工艺，我们选择水溶性成分提取最佳工艺，即10%的黄酒，加20%的酒量，在80 ℃炒炙4 min。
3.2 影响因素探讨
方差分析表明，酒的种类影响最显著，这与大多数文献报道相同;其次是酒的用量，而炒炙时间、炒炙温度影响较小。传统炮制技术中关于炒制火候的规定为文火，较为含糊，实际操作全凭经验。本研究采用80、110、160 ℃进行炒炙，最佳工艺的炒炙温度为80 ℃，虽然与文献报道文火的温度掌握在120～130 ℃有一定的差别，但80 ℃与110 ℃的煎出率、成品性状相似，160 ℃酒炙品焦斑明显，甚至呈焦褐色，成品外观较差。说明火候对酒炙品的质量影响较大。
3.3 炮制对化学成分的影响
从试验来看，炮制对各类成分的影响表现出一定程度的多向性，酒炙品水煎出物中脂溶性成分的含量非常低，但其中的丹酚酸B明显高于生品(12.56 mg/g)，可能是因为酒炙过程改变了药物的物理性状，有利于丹酚酸B的浸润、溶解、扩散等，提高了其溶出率[5]。
参考文献
[1] 甘肃省食品药品监督管理局.甘肃省中药材标准[S].兰州：甘肃文化出版社，2009.72.
[2] 赵建邦.甘肃丹参的研究与应用评价[J].中药材，2003，26(7)：581.
[3] 杨树声，宋平顺.丹参类药材脂溶成分HPLC测定[J].兰州大学学报(自然科学版)，2009，35(4)：61.
[4] 杨树声，宋平顺.丹参类药材水溶成分HPLC测定[J].甘肃中医学院学报，2008，23(6)：43.
[5] 冉懋雄，郭建民.现代中药炮制手册[M].北京：中国中医药出版社， 2002.133，147，282.