周氏克金岩方抗肺癌A549细胞有效部位Ⅰ成分分析研究

　　　　 作者：董静，尹莲，张旭，段金廒

【摘要】 目的 对周氏克金岩方有效部位Ⅰ的成分进行定性定量分析，为深入研究周氏克金岩方抗肺癌有效部位群物质基础奠定基础。方法 通过试管反应和TLC方法定性鉴别有效部位成分，建立亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量、香兰素-冰醋酸-高氯酸比色法测定总皂苷的含量。结果 周氏克金岩方有效部位Ⅰ中主要含黄酮、皂苷类成分，含量分别为0.85%、1.07%，纯度分别为29.7%、37.4%。结论 周氏克金岩方有效部位Ⅰ中主要含有黄酮和皂苷类成分，总纯度为67.1%。

【关键词】 周氏克金岩方；定性鉴别；黄酮；皂苷

　　Abstract：Objective To study material basis of Zhou’s prescription， components of effective parts Ⅰ in Zhou’s prescription was gualitative and quantitative analyzed. Methods The components of effective part Ⅰ was identified by test-tube reaction and qualitative TLC method， the content of saponins and flavones was quantitative analyzed. Results Total content of the saponins and flavone are 1.07% and 0.85% in Zhou’s Prescription. The purity of saponins and flavones in effective parts Ⅰ are 37.4% and 29.7%. Conclusion The main components of effective part Ⅰ in Zhou’s Prescription were flavones and saponins.

　　Key word：Zhou’s prescription；qualitative identification；saponins；flavones

　　周氏克金岩方为我国著名中医周仲瑛教授临床治疗肺癌的经验方，主要由麦冬、沙参、鱼腥草、红花等组成。对周氏克金岩方有效部位系统评价，已筛选出对肺癌A549细胞有显著毒性的有效部位Ⅰ。本研究系统分析周氏克金岩方有效部位Ⅰ成分，以明确其成分类型及含量，为进一步研究该方物质基础及作用机制奠定基础。

　　1 材料

　　1.1 药材

　　麦冬、南沙参、红花、鱼腥草均购自安徽亳州药材市场。

　　1.2 试剂

　　标准品：薯蓣皂苷元(中国药品生物制品检定所，批号1539-200001)，芦丁(自制)。高氯酸、冰醋酸、亚硝酸钠、硝酸铝为分析纯，香兰素(T20050915)。

　　1.3 仪器

　　752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)， RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣)，电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，2401-UV检测器等。

　　2 方法与结果

　　2.1 供试品溶液的制备

　　精密称取全方药材粉末2.782 0 g，70%乙醇浸泡1 h，回流
提取，合并提取液，用石油醚萃取，弃去石油醚层，水层回收至干，用70%乙醇定容至50 mL，取5 mL置25 mL量瓶中，制成全方供试品Ⅰ-1。精密称取全方药材粉末1.670 g，70%乙醇浸泡，回流提取，合并提取液，回收至无乙醇，依次通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并正丁醇液，回收至干，用70%乙醇定容至50 mL量瓶中，取5 mL挥干溶剂，甲醇定容至25 mL量瓶，制成全方供试品Ⅰ-2，取10 mL用70%乙醇定容至25 mL量瓶，制得全方供试品Ⅰ-3；取全方药材粉末少量，用水提取得全方供试品Ⅰ-4。取有效部位Ⅰ分别用70%乙醇、甲醇和水定容至50 mL，制得供试品Ⅱ-1、供试品Ⅱ-2和供试品Ⅱ-3；麦冬、沙参、鱼腥草、红花等药材少量，用70%乙醇加热提取，经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取，将正丁醇萃取液回收至干，分别用水和甲醇溶解，制得单味药样品液，分别为供试品Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取芦丁对照品0.010 g，甲醇定容至50 mL，即得0.02 mg/mL芦丁对照品溶液；精密称取薯蓣皂苷元对照品0.004 65 g，甲醇定容至10 mL，即得0.465 mg/mL薯蓣皂苷元对照品溶液。

　　2.3 定性鉴别

　　2.3.1 理化反应

　　将供试品Ⅰ-1、供试品Ⅰ-3、供试品Ⅱ-1、供试品Ⅱ-3进行试管反应，结果见表1。由表1可知，全方及有效部位Ⅰ中主要含有黄酮及皂苷类成分。表1 定性鉴别结果(略)

　　2.3.2 TLC鉴别

　　全方供试品Ⅰ-1、有效部位Ⅰ供试品Ⅱ-1及单味药供试品Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ于聚酰胺薄膜点样，以80%乙醇为展开剂，以AlCl3的乙醇溶液为显色剂，在紫外光灯(365 nm)下检视。供试品Ⅰ-1、供试品Ⅱ-1及单味药供试品Ⅳ、Ⅵ均有黄绿色荧光斑点，推测可能有黄酮类成分。将上述供试液用硅胶G薄层板，以氯仿-甲醇(1∶2)为展开剂，展距约15 cm，展开，取出，晾干，分别喷香草醛-浓硫酸溶液和5%FeCl3溶液，显紫色和棕绿色斑点，推测可能有酚性成分及萜类成分。

　　2.4 含量分析

　　2.4.1 吸收波长的确定

　　精密吸取芦丁标准品液、供试品Ⅰ-1、供试品Ⅱ-2各1 mL分别置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，加入10%Al(NO2)3溶液0.4 mL，摇匀，6 min后再加入10%NaOH溶液4 mL，用水定容至刻度，摇匀，15 min后，分别置UV-2401紫外分光光度计中扫描。结果标准品和供试品Ⅰ、供试品Ⅱ-2在510 nm左右均有最大吸收峰，由此确定测定总黄酮的最佳检测波长为510 nm。

　　精密吸取薯蓣皂苷元标准品液、供试品Ⅰ-2、供试品Ⅱ-1各1 mL，置于10 mL具塞的试管中，70 ℃水浴挥干溶剂，各精密加入5%香兰素-冰醋酸0.2 mL，再加高氯酸0.8 mL，摇匀，密塞，在60 ℃水浴中加热15 min，迅速移至冰浴中，各精密加入5 mL冰醋酸，摇匀，以相应的试剂为空白，在UV-2401紫外分光光度计中扫描。结果表明，薯蓣皂苷元标准品液和样品液在455 nm左右均有最大吸收峰，由此确定检测波长为455 nm。

　　2.4.2 标准曲线的建立

　　2.4.2.1 总黄酮

　　精密吸取标准品溶液0.2 、0.4、0.8、1.6 、3.2 mL分别置于10 mL容量瓶中，按照“2.4.1”项下黄酮测定方法测吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁体积为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y＝11.008X＋0.002 2，r＝0.999 5。

　　2.4.2.2 总皂苷

　　分别精密吸取对照品溶液70、100、130、160、190、220 μL置10 mL具塞的试管中，按照“2.4.1”项下皂苷测定方法测吸光度，绘制标准曲线，得回归方程：Y＝0.004X＋0.009 7，r＝0.999 0。

　　2.4.3 精密度考察

　　供试品Ⅰ及供试品Ⅱ分别按照“2.4.2.1”和“2.4.2.2”项下方法，在同一条件下连续测定吸光度5次，RSD分别为2.08%和1.53%，说明精密度良好。

　　2.4.4 重复性考察

　　分别精密称定全方药材粉末2.782 0 g、1.670 0 g各5份，按照“2.4.1”项下方法分别制得供试品Ⅰ及供试品Ⅱ，分别按照“2.4.2.1”和“2.4.2.2”项下的方法测定吸光度，结果表明，供试品Ⅰ及供试品Ⅱ的RSD分别为1.24%和3.43%，说明重复性好。

　　2.4.5 稳定性考察

　　供试品Ⅰ及供试品Ⅱ分别在0、5、10、15、20 min和0、10、30、60、90 min，按照“2.4.2.1”和“2.4.2.2”项下方法进行测定。供试品ⅠRSD＝4.3%，说明该样品在20 min内稳定；供试品ⅡRSD＝0.73%，说明该样品在90 min内稳定。

　　2.4.6 加样回收率

　　称定全方6份，每份0.4 g，加入芦丁对照品溶液，按照“2.4.1”项下供试品Ⅰ-1的制备和“2.4.2.1”项下的方法测定吸光度值，供试品Ⅰ加样回收率见表2。
　　
　　称定全方6份，每份0.5 g，加入薯蓣皂苷元对照品溶液，按照“2.4.1”项供试品Ⅰ-2制备和“2.4.2.2”项下的方法测定吸光度值，供试品Ⅱ加样回收率见表3。表2 黄酮加样回收率考(略)表3 皂苷加样回收率考察(略)

　　2.4.7 含量及纯度测定

　　精密吸取供试品Ⅰ-1、供试品Ⅱ-2各1 mL，置10 mL容量瓶中，按照“2.4.2.1”项下方法，在同一条件下测定吸光度，代入Y＝11.008X＋0.002 2回归方程计算其含量；精密吸取供试品Ⅰ-2、供试品Ⅱ-2各1 mL，置10 mL具塞试管中，按照“2.4.2.2”项下方法，在同一条件下测定吸光度，代入Y＝0.004X＋0.009 7回归方程计算其含量。取供试品Ⅱ-2和供试品Ⅱ-3回收至干，105 ℃烘箱烘至恒重，计算纯度。结果见表4。结果表明，有效部位Ⅰ中总黄酮、皂苷类成分为67.1%。表4 含量测定结果(略)

　　3 讨论

　　通过对周氏克金岩方全方、有效部位及各组方药中各类成分的系统定性鉴定，初步了解了方中各类成分类型、有效部位Ⅰ中成分类型。

　　文献报道，皂苷的含量测定方法有重量法、溴量法、紫外分光光度法、比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相-质谱法等 [1]。总黄酮含量测定方法主要为紫外可见分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、荧光分光光度法、毛细管电泳法等[2]。本研究建立了该复方总黄酮及总皂苷含量测定方法，该含量测定方法准确、简便、灵敏、重复性好、精密度高，适用于本方总皂苷、总黄酮的含量测定。通过对全方及有效部位Ⅰ中黄酮、皂苷类成分含量分析显示，有效部位Ⅰ主要由黄酮、皂苷类成分组成，两者的纯度总和为67.1%。
　　
　　周氏克金岩方有效部位Ⅰ对肺癌A549细胞有显著的细胞毒性，因此，拟进一步分离纯化有效部位Ⅰ中的黄酮类成分和皂苷类成分、抗肺癌活性评价，为深入研究周氏克金岩方中抗肺癌物质基础奠定基础。

参考文献