针刺对脑缺血大鼠海马区凋亡细胞及Caspase-9蛋白表达的影响

论文价格:0元/篇 论文用途:仅供参考 编辑:论文网 点击次数:0
论文字数:**** 论文编号:lw2023113221 日期:2025-08-24 来源:论文网

   作者:马惠芳,林彩霞,任秀君,图娅

【摘要】 目的 观察针刺对脑缺血损伤大鼠大脑海马区凋亡细胞及Caspase-9蛋白表达的影响,探讨针刺对脑缺血损伤的神经保护机制。方法 雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组,每组10只,采用化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉造成大鼠局灶性脑缺血模型。针刺“百会”、“水沟”,每日1次,治疗7 d。应用苏木素-伊红染色(HE)及免疫组化方法观察针刺前后大鼠缺血区凋亡细胞及海马区Caspase-9蛋白表达的变化。结果 大鼠局灶性脑缺血后Caspase-9表达增加,针刺对脑缺血损伤大鼠Caspase-9的过度表达有明显抑制作用。HE染色显示,缺血灶内大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,针刺治疗后变性坏死细胞明显减少。结论 针刺可减轻Caspase-9的过度表达,改善脑缺血状态,从而减轻脑损害程度,这可能是针刺减轻脑缺血损伤的机制之一。

【关键词】 脑缺血;针刺;Caspase-9;凋亡细胞;大鼠

  Abstract:Objective To observe the effect of acupuncture on apoptosis and Caspase-9 expression in hippocampus of cerebral ischemia (CI) rats. Methods Thirty male SD rats were randomized into control, CI and CI + acupuncture group, with 10 cases in each group. CI model was established by occlusion of the unilateral middle cerebral artery. “Baihui” (GV20) and “Shuigou” (GV26) were acupunctured once daily for 7 days. The apoptosis and expression of protein Caspase-9 in hippocampus was displayed by HE staining and immunohistochemical method. Results In comparison with the normal control group, Caspase-9 immune reaction (IR) positive cells in the hippocampus of CI group increased significantly (P<0.01). Caspase-9 IR positive cells in the hippocampus of CI + acupuncture group decreased significantly (P<0.01). HE staining showed that there was a lot of neuron degenerateion and necrosis in the ischemia focus, and the manifestations of cerebral edema were observed. Degeneration and necrosis of cells was significantly decreased after acupuncture. Conclusion Acupuncture can eliminate cerebral ischemia induced abnormal expression of Caspase-9 and alleviate cerebral lesion in cerebral ischemia rats. These may be one of the mechanisms of acupuncture lightening the cerebral ischemia.

  Key words:cerebral ischemia;acupuncture;Caspase-9;apoptotic cell;rat

  在细胞凋亡的发生机制中,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活是一关键的环节,最终引起染色体DNA的降解及细胞的解体[1]。目前已知的Caspases家族成员有14个,其中Caspase-9在细胞凋亡中起重要作用。为了探讨针刺抑制局灶性脑缺血损伤模型大鼠神经元凋亡的机理,本实验观察了局灶性脑缺血损伤大鼠海马区Caspase-9表达的变化及针刺的影响,探讨针刺对脑缺血损伤的神经保护机制。

  1 材料与方法

  1.1 动物与分组

  健康成年SD大鼠,清洁级,雄性,体重(200±20)g,购于北京维通利华公司实验动物中心。动物随机分为正常对照组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组,每组10只。

  1.2 脑缺血模型制作

  按Tamura等的方法[2],稍加改进。将大鼠用10%水合氯醛 (0.35 mL/kg)腹腔麻醉后,侧卧位,于眼眶后至耳的中点纵行切开皮肤约2 cm,分离并切去部分颞肌,暴露颞骨,做一直径约3~5 mm的骨窗,轻抬脑,可见到横过嗅束向上走行的大脑中动脉(MCA),将浸有500 g/L FeCl3(50% FeCl3,用0.1 mol/L HCl配置)溶液10 μL的定量滤纸敷于暴露的MCA上20 min。术区洒适量庆大霉素液,然后缝合皮肤,再于术口处局部使用青霉素粉少许消炎抗菌。

  1.3 处理方法

  正常对照组:在治疗时也每日抓取1次,但不做其他处理。脑缺血模型组:造模后同期抓取大鼠,但不予任何治疗, 7 d后处死取材。脑缺血治疗组:造模后24 h开始针刺百会、水沟,每日1次,治疗7 d后处死取材。针刺方法:百会平刺2 mm,捻转1 min,留针20 min;水沟点刺1 mm,捻转1 min,不留针。

  1.4 取材

  动物存活期满后(观察时间共60 d),以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉,迅速断头开颅取脑,置10%甲醛中固定1周。脑组织常规处理,石蜡包埋,切片,厚4 μm,常温保存备用。

  1.5 检测方法

  免疫组化法(试剂盒由中杉试剂公司提供)检测。具体步骤如下:①组织切片常规脱蜡至水;②蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min;③3%h3O2去离子水,室温下放置5~10 min,以灭活内源性过氧化酶活性;④滴加正常山羊血清封闭液,室温10~15 min,甩去多余液体,不洗;⑤滴加适当稀释的Caspase-9的一抗(兔IgG),4 ℃过夜;⑥PBS(pH 7.2~7.6)冲洗3 min×3次;⑦滴加生物素标记山羊抗兔IgG,20~37 ℃下放置10~15 min,PBS冲洗,3 min×3次;⑧滴加三抗辣根酶标记链霉卵白素工作液,20~37 ℃下放置10~15 min,PBS冲洗,3 min×3次;⑨滴加显色剂DAB显色,显色时间10~30 min;蒸馏水洗涤,封片镜检;⑩阴性对照:切片省略第5步,其他处理同上。普通光镜观察、照相。采用多功能真彩色病理图像分析管理系统(CMIAS2001A型,北京煤炭总医院提供)对脑组织切片进行定量分析。每只动物于海马区各选3张切片,每张切片随机选取10个视野。观察并对阳性细胞数进行计数分析(每10个观察细胞中阳性细胞所占比例)。

  1.6 病理形态学观察

  苏木素-伊红染色(HE)观察缺血神经细胞坏死现象。染色步骤如下:①石蜡切片脱蜡;②下行逐级浸水,水洗5 min;③苏木素(先去氧化层)10 min,水洗3~5 min;④盐酸酒精分化(过一下),水洗2~5 min;⑤1%碳酸锂返蓝(过一下);水洗2~5 min;⑥伊红染液1 min;⑦上行逐级脱水;⑧透明;⑨中性树胶封片镜检。

  1.7 统计学方法

  实验数据应用SPSS统计软件处埋,数据用x±s表示,进行单因素方差分析,并进行组间多重比较,以P<0.05、P<0.01作为差异有统计学意义的标准。

  2 结果

  2.1 针刺对脑缺血大鼠海马区Caspase-9表达的影响

  正常对照组大鼠海马区可见散在的弱阳性细胞,胞体较大,着色较浅。造模后7 d,各脑缺血模型组海马区的阳性细胞数明显增多,着色较深,多为胞浆着色。结果显示,正常对照组大鼠海马区组织切片中可见少量Caspase-9阳性细胞表达,脑缺血模型组在造模7 d后海马区Caspase-9阳性细胞数明显增多,与正常对照组比较,P<0.01;脑缺血治疗组经针刺治疗7 d后,海马区Caspase-9阳性细胞数显著减少,与脑缺血模型组比较,P<0.01。见表1。表1 各组大鼠脑组织海马区Caspase-9表达的阳性细胞数(略)注:与脑缺血模型组比较,※※P<0.01;与正常对照组比较,☆☆P<0.01


  
  2.2 电针对大鼠脑组织病理学改变的影响

  在光镜下观察,正常对照组的神经细胞形态正常,间质致密无水肿,海马区神经元细胞形态正常,细胞核无固缩或溶解,核仁清晰可见;脑缺血模型组缺血区出现大量神经元变性坏死,伴有轻度炎性细胞浸润,神经元纤维疏松,细胞数明显减少,出现细胞肿胀,胞核碎裂、溶解等细胞坏死特征,海马区神经元排列稀疏紊乱。

  而予以针灸治疗后,缺血区周围组织水肿现象有不同程度减轻,仅有部分或少许神经元核固缩现象,神经元受损减轻,梗死灶周围结构完整的神经细胞明显增多,海马区的神经元排列相对比较整齐,变性坏死细胞明显减少。

  3 讨论

  Csapases是一组与秀丽隐杆线虫同源的执行哺乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族,绝大部分细胞凋亡依赖于Caspases的存在。目前已鉴定的哺乳动物Caspases有14种,通常它们以无活性的酶原形式存在于胞质内,当有致凋亡刺激存在时被激活。Caspases酶原包括3个部分:原域、大亚单位和小亚单位。酶原本身的活性很低,但可以通过不同的方式被激活。一旦原域以及大、小亚单位之间的连结被切除,大小亚单位之间相互作用形成一个异二聚体,其中包含一个活性位点,2个异二聚体形成1个四聚体,成为Caspases的活化形式[1]。

  活化的Caspases通过特异性裂解底物而发挥其执行细胞凋亡的功能,在细胞凋亡机制中居于中心地位。凋亡信号经过复杂的信号传递之后,最终汇聚于一点,即Caspases的激活。一个细胞的凋亡有多种Caspases参与,不同细胞、不同刺激可启动不同的Caspases激活方式。大量资料表明,Caspases的激活是级联反应模式。当受到促凋亡信号刺激时,Caspases活化并触发下游的蛋白水解级联反应,Caspases均在其底物特定的天门冬氨酸残基处裂解,位于上游的启动Caspases依次激活下游的凋亡执行Caspases,因此建立起Caspases的级联。在此级联中,Caspase-8作为始动蛋白酶,它激活一系列蛋白酶如Caspase-9和Caspase-7。最后激活Caspase-3,被激活的Caspase-3再参与Caspase-9激活的正反馈环路[3]而最终引起细胞凋亡。朱氏等[4]也发现局灶性脑缺血再灌注48 h内Caspase-9 mRNA表达增强。林氏等[5]认为,全脑缺血再灌注后Caspase-9 mRNA表达上调可促进神经元凋亡发生。脑缺血早期是治疗疾病的最佳时期,可通过拮抗Caspase-9的表达抑制凋亡,以尽可能减少梗死体积扩大。
  
  中医理论认为,中风的病因病机主要以脉络不通、元神损伤为主,故治疗应以调畅脉络、通督治脉为主。“百会”与“水沟”皆为督脉经穴,百会为诸阳之会,通督治脉;水沟可接续阴阳之气、醒神开窍。
  
  本实验结果表明,脑缺血损伤发生后,在大鼠海马区Caspase-9表达的阳性细胞数量显著增多,针刺后大鼠海马区Caspase-9有明显下降,说明针刺具有减轻Caspase-9对脑组织损害的作用,这可能是针刺减轻脑缺血损伤的机制之一。HE染色结果亦表明,大鼠脑缺血后海马区有大量的细胞坏死死亡,针刺可减少细胞死亡的数量,进一步说明针刺对脑缺血损伤的治疗作用。

参考文献


  [1] Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases:enemies within[J]. Science, 1998,281(5381):1312-1316.

  [2] Tamura A, Graham DI, Mcculloch J, et al. Focal cerebral ischemia in rats:1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab,1981,1(1):53-60.

  [3] Fujila E, Egashira J, Urase K, et al. Caspase-9 processing by caspase-3 via a feedback amplification loop in vivo[J]. Cell Death Differ,2001,8:335-344.

  [4] 朱 炬,王纪佐.大鼠局灶性脑缺血后再灌注期Caspase-9 mRNA及Apaf-1 mRNA表达的动态变化[J].中国神经科杂志,2003,11(1):23-26.

  [5] 林晓英,李中昕,张 峰,等.大鼠全脑缺血再灌注的动态表达及凋亡[J].山东医药,2005,45(19):20-21.

如果您有论文相关需求,可以通过下面的方式联系我们
客服微信:371975100
QQ 909091757 微信 371975100