作者：郭玉岩，李敏，史磊，李永吉
【摘要】 目的 建立盐酸青藤外敷散中盐酸青藤碱含量的测定方法。方法 采用HPLC法，Diamonsil ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液，加1‰三乙胺，用磷酸调pH至3.0)-甲醇(80∶20)，流速为1.0 mL/min，检测波长265 nm。结果 盐酸青藤碱在0.446～4.46 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y＝9.01×106X＋102 803(r＝0.999 9)。平均加样回收率为99.2%，RSD＝0.68%(n＝9)。结论 该法操作灵敏、准确、重复性好，可作为盐酸青藤外敷散的质量控制方法。
【关键词】 盐酸青藤外敷散；盐酸青藤碱；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a method for the determination of content in Sinomenine Hydrochloride external applied powder. Methods Diamonsil ODS C18 (250 mm×4. 6 mm， 5 μm) column was used in HPLC with mobile phase of phosphate buffer (0.01 mol/L K2HPO4 solution， and 1‰ triethylamine， pH was adjusted to 3.0)-MeOH (80∶20). The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 265 nm. Results The linear range of Sinomenine Hydrochloride was 0.446～4.46 μg and the regression equation was Y＝9.01×106X＋102 803 (r＝0.999 9). The average recovery was 99.2%， RSD＝0.68% (n＝9). Conclusion This method is rapid and accurate with good reproducibility. It can be applied to control the quality of Sinomenine Hydrochloride external applied powder.
Key words：Sinomenine Hydrochloride external applied powder；Sinomenine Hydrochloride；HPLC；content determination
青藤碱(sinomenine)是从青风藤Sinomenium acutum (Thunb.) Rehd. et Wils.中提取的生物碱单体，盐酸青藤碱为其盐酸盐，临床用于治疗风湿、类风湿性关节炎及心率失常等[1]。盐酸青藤外敷散是以盐酸青藤碱为主要有效成分制备的经皮给药制剂，主要用于治疗类风湿性关节炎。为建立其可靠的质量控制方法，本试验采用HPLC法测定制剂中盐酸青藤碱的含量，现报道如下。
1 试药与仪器
盐酸青藤外敷散(自制，批号20080301、20080302、20080303)；青藤碱对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号0775-200105)。甲醇(色谱纯，DIKMA TECHNOLOGY INC)，实验所用其他试剂均为分析纯。
Waters高效液相色谱仪，含有在线脱气、高压四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)、Empower色谱工作站(美国)；分析天平(Sartorius CP225D)；酸度计(梅特勒-托利多DELTA 320)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
DIKMA Diamonsil ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液，加1‰三乙胺，用磷酸调pH至3.0)-甲醇(80∶20)；流速为1.0 mL/min；检测波长265 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按盐酸青藤碱计应不低于2 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液制备
取经干燥至恒重的青藤碱对照品5.0 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液制备
称取本品60.0 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，静置15 min，取上清液滤过，即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例加入相关辅料，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制成相当于供试品中辅料浓度的阴性对照溶液。
2.3 系统适用性试验
精密吸取已制备好的对照品、供试品和阴性对照溶液，照“2.1”项下色谱条件，各进样10 μL，色谱图见图1。结果表明，供试品与对照品溶液均在相同保留时间内出现盐酸青藤碱吸收峰，阴性对照液在该处无吸收，说明本试验条件下盐酸青藤碱峰与其他组分峰分离完全。
2.4 进样精密度试验
取对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，计算相对标准偏差。结果RSD＝1.14%(n＝6)，表明精密度良好。
2.5 线性关系考察
精密称取相当于盐酸青藤碱4.46 mg的对照品(青藤碱对照品3.66 mg)，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为储备液。精密吸取储备液1、2、7、8 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释定容，得到含量为0.0 446、0.0 892、0.3 122、0.3 568 mg/mL的对照品溶液及浓度为0.446 mg/mL的储备液，分别进样10 μL测定，以对照品含量对峰面积进行线性回归，得到回归方程：Y＝9.01×106X＋102 803(r＝0.999 9)。结果表明，盐酸青藤碱在0.446～4.46 μg浓度范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
按“2.2.2”项下方法制成样品5份，按“2.1”项下条件测定，计算含量及相对标准偏差。结果RSD＝1.65%，表明测定精密度良好。
2.7 稳定性试验
按“2.2.2”项下方法制成样品，分别放置2、4、7 h，测定其峰面积，计算相对标准偏差。结果RSD＝0.88%，表明样品在放置7 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密称取对照品11.74 mg(相当于盐酸青藤碱14.30 mg)置10 mL量瓶中，用甲醇溶解，作为储备液。精密移取储备液各1 mL，分别置9个25 mL量瓶中，分别称取供试品，加甲醇溶解，定容至刻度，使浓度成测定浓度的80%、100%、120%，各3份。进样测定，计算测得量及回收率。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 样品含量测定
取3批盐酸青藤外敷散，依法制成供试品溶液，测定样品中盐酸青藤碱的含量。结果见表2。表2 3批样品含量测定结果(略)
3 讨论
笔者曾根据文献[2-3]，采用甲醇-0.01 mol/L Nah3PO4(50∶50)、乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)进行盐酸青藤碱含量的测定，结果保留时间较短，难以与溶剂峰分离，且峰型不佳。故对流动相pH值进行了考察，分别采用pH值为2.5、3.0、4.0、5.0的磷酸盐缓冲液体系进行色谱行为考察，结果表明，随pH值的升高主成分峰拖尾严重，且峰型不好。经比较，pH值在2.5时峰型最佳，无拖尾现象，理论板数高，pH值3.0与其接近，考虑到色谱柱的耐酸程度，本方法采用pH值为3.0的流动相体系。通过调节磷酸盐缓冲液-甲醇的不同比例(45∶55、50∶50、55∶45、70∶30、80∶20)，比例为80∶20时保留时间为10 min，可将主峰与杂质成分有效分离，且可以节省时间，降低流动相的消耗。故本试验最终确定的流动相体系为磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液，加1‰三乙胺，用磷酸调pH至3.0)-甲醇(80∶20)。
由于本制剂中含有糊精等粘度较大的物质，在样品处理过程中，用甲醇溶解样品时，需静置15 min以上，将辅料沉淀后，再滤过，测定。
本试验采用高效液相色谱法建立了盐酸青藤外敷散的中盐酸青藤碱含量测定方法，通过对方法的精密度、线性关系、回收率、稳定性等考察，验证本法精密、准确，为盐酸青藤外敷散的质量标准研究提供了依据。
参考文献
[1] 刘 强，周莉玲，李 锐.青藤碱的研究概况[J].中草药，1997，28(4)：247.
[2] 潘细贵，罗顺德，张先洲，等.高效液相色谱法测定青藤碱片中青藤碱的含量[J].时珍国医国药，2001，12(7)：593.
[3] 张丽锋，张淑秋.高效液相色谱法测定盐酸青藤碱控释微丸的含量[J].山西医科大学学报，2006，37(7)：720.
[4] WS-10001-(HD-0752)-2002，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂[S].