作者：霍清萍，梁芳，李金菩，王宇新，孔林，王兵
【摘要】 目的 观察稳消颗粒对兔实验性动脉粥样硬化单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法 将36只健康新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、稳消颗粒组、辛伐他汀组。除正常组外，其余各组给与高脂饮食，建立兔动脉粥样硬化模型，根据体重比例折算临床剂量给予相应药物治疗。药物治疗8周后处死动物，取腹主动脉根部行免疫组化染色法，观察兔腹主动脉根部动脉粥样硬化MCP-1、TNF-α的表达。结果 与模型组比较，稳消颗粒组、辛伐他汀组MCP-1、TNF-α的表达均明显下调(P＜0.05)；稳消颗粒组与辛伐他汀组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 稳消颗粒可抑制MCP-1、TNF-α的表达，益于动脉粥样硬化斑块防治与稳定。
【关键词】 稳消颗粒；动脉粥样硬化；单核细胞趋化蛋白-1；肿瘤坏死因子-α；动物模型
Abstract：Objective To observe the effect of Wenxiao Granule on the expression of MCP-1 and TNF-α in experimental atherosclerosis rabbit， and explore its mechanism in treating atherosclerosis. Methods Thirty-six New Zealand rabbits were randomized to four groups：control group， Wenxiao granule group， Simvastatin group. They were fed a high-fat diet except normal group until the mature atherosclerotic plaques formed. The rabbits in two drug-treated groups were treated with respective drug for 8 weeks. All rabbits were sacrificed. The morphology and composition of atherosclerotic plaques in aortic roots were examined. The expression of MCP-1 and TNF-α were determined by immunohistochemical staining. Results The expression of MCP-1 and TNF-α in plaque of Wenxiao Granule group and simvastatin group were significantly dereased compared with the model group (P＜0.05)， and there was no difference between the two drug-treated groups (P＞0.05). Conclusion Wenxiao Granule can inhibit the expression of MCP-1 and TNF-α，which may stabilize plaque of atherosclerosis.
Key words：Wenxiao Granule；atherosclerosis；MCP-1；TNF-α；animal model
越来越多的证据表明，炎症贯穿于动脉粥样硬化病变及其斑块发生、发展全过程。炎症反应激活巨噬细胞等炎性细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子，直接或间接的作用于粥样斑块内基质，抑制其合成，促进其降解，使斑块易于破裂，触发不良事件[1]。所以，促进斑块稳定是业内研究关注的热点。稳消颗粒是本院治疗该病的经验方，临床疗效较好。本研究通过喂饲高脂饲料建立兔动脉粥样硬化模型，观察稳消颗粒对炎症因子MCP-1、TNF-α的表达影响，探讨稳消颗粒抗动脉粥样硬化斑块的作用机制。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
36只体重2.2～2.5 kg健康新西兰大白兔，月龄3～4个月，雌雄不限，购自上海市中国科学院实验动物中心。
1.2 药物
稳消颗粒(免煎)，江阴天江药业有限公司代为生产，批号20070810。水蛭、丹参、赤芍、半夏、石菖蒲、胆南星、牡丹皮、黄芩，各药按2∶2.5∶2.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2.5∶1比例混合。辛伐他汀(商品名舒降之)，默沙东公司出品，批号20070114。用药剂量，根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按人与动物体重比例折算，折合实验兔用量：水蛭660 mg/kg；丹参、牡丹皮、赤芍各825 mg/kg；石菖蒲、胆南星、半夏各495 mg/kg，黄芩330 mg/kg。辛伐他汀1.1 mg/kg。以上药物以蒸馏水溶解，混匀后灌胃。
1.3 试剂与仪器
DAB显色试剂盒为Sigma公司产品；山羊血清、Envision即用型试剂均系DAKO公司产品；MCP-1一抗(稀释度1∶250)， Santa Cruz公司(批号sc-1785)；TNF-α一抗(稀释度1∶200)，北京博奥森公司(批号20070904)。光学显微镜，日本Olympus Bh3；IMS细胞图像分析系统，上海申腾信息技术有限公司。C-反应蛋白试剂盒，美国DARE BEHRING公司；凝血全套试剂盒，日本Sysmex公司。
1.4 造模
所购实验兔饲养在上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心，饲养条件2级，室温保持在22～24 ℃，相对湿度50%，光照时间7:00－17:00。给予150 g/d的标准饲料，观察7 d无异常后，除正常组外，其余实验兔给与高脂饮食100 g/d，余由标准饲料补足，自由饮水。高脂饲料喂养至第8周，随机处死实验兔1只，于腹主动脉至髂总动脉分叉处(以左右髂动脉分叉为参照)，向上留取2 cm标本，作石蜡切片，光镜下观察造模情况，结果大体观察兔腹动脉均有不同程度的动脉粥样硬化改变。HE染色显示，实验兔腹动脉内膜出现弥漫性、融合成片的黄色斑块，确认造模成功。
1.5 分组、给药及取材
确定造模成功后，随机分为稳消颗粒组(8只)、辛伐他汀组(9只)、模型组(9只)。给药组分别给予稳消颗粒、辛伐他汀，模型组、正常组均给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次。各组均采用标准饲料喂养，自由饮水。共8周。实验结束禁食禁水12 h，速眠新Ⅱ(0.8～1.2 mL/kg)麻醉，处死全部实验兔。剥离、暴露腹主动脉至髂总动脉分叉处，以左右髂动脉分叉为参照，向上留取2 cm标本，剥离腹主动脉外膜的结缔组织，0.9%氯化钠溶液冲洗干净，水平展开腹主动脉内膜，肉眼观察腹主动脉内膜的变化——粥样斑块形态、分布。按分组英文字母标记，10%甲醛固定，液氮骤冷，-40 ℃保存。至实验结束，5只兔死亡，其中模型组因坏疽继发感染死亡1只、正常组因肺炎死亡1只、辛伐他汀组因腹泻死亡2只、稳消颗粒组不明原因死亡1只。正常组余兔8只，模型组8只，辛伐他汀组7只，稳消颗粒组7只。辛伐他汀组行动物处死后发现肝硬化伴腹水2只。
1.6 观察项目及检测方法
MCP-1、TNF-α，均采用免疫组织化学染色法检测。步骤如下：组织标本，常规脱水，透明，包埋和切片；石蜡切片4 μm贴在涂有切片粘合剂的载玻片上，58 ℃烤24 h，常规脱蜡水化，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，无水乙醇95%、85%、75%各2 min，水洗；0.01 mol/L pH值为7.4，PBS洗3×3 min；1%h3O2作用20 min，PBS洗3×3 min；抗原修复2×10 min，自然冷却至室温，将切片置于0.01 mol/L CB(pH值6.0柠檬酸缓冲液)，微波Ⅲ档(98 ℃)10 min×2，PBS洗3×3 min；1%正常血清封闭20 min，室温；加适当稀释一抗，4 ℃，18 h，PBS洗3×3 min；Envision试剂30 min，37 ℃，PBS洗3×3 min；0.04% DAB＋0.03%h3O2显色8 min，水洗；苏木素衬染30 s，水洗；盐酸乙醇蓝化2 s，水洗；微波蓝化，常规树脂封片。250倍镜下每张切片选取5个不同的视野，对阳性区域累积面积进行定量测定，采用IMS细胞图像分析系统计算表达阳性面积占总面积比(%)。
1.7 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件，数据以x±s表示，组间比较采用方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
(见表1)表1 各组兔主动脉根部MCP-1、TNF-α阳性面积百分比比较(略)注：与正常组比较，☆P＜0.01；与模型组比较，▽P＜0.01
3 讨论
长期以来，中医治疗动脉粥样硬化多围绕活血、化瘀、化痰、通络、补虚而变化应用，强调活血化瘀为其治疗大法。因而中医药对于颈动脉粥样硬化斑块的研究，也多采取益气、健脾、补肾、理气、活血、化痰等法，并以血脂、氧化低密度脂蛋白、脂质过氧化物、内皮素、一氧化氮、超氧化物歧化酶、丙二醛、花生四烯酸等的变化为观察指标。稳消颗粒方中选用水蛭破血逐瘀为君药；辅以丹参、赤芍活血化瘀，石菖蒲、胆南星、半夏温化痰浊；佐使丹皮、黄芩清热。共起活血通络、温化痰浊、清热化瘀作用。长期临床诊治发现，相当部分动脉粥样硬化斑块患者，临床表现为痰湿瘀滞，且蕴而化热。考虑可能与生活节奏快，竞争压力大，易肝郁气滞，气郁化火，日久耗伤阴血，灼血生瘀；加之吸烟、饮酒、多食肥甘内生痰浊；久病入络，痰湿瘀滞内结，血脉艰涩；瘀滞艰涩越久，蕴热愈盛有关。认为痰浊蕴聚、热瘀互结当是动脉粥样硬化斑块发生的病机之一。据此，采用活血通络、温化痰浊、清热化瘀法治疗该病，在缓解临床症状、控制病情等方面均收到了较好的效果。
动脉粥样硬化斑块的形成是一个复杂的病理生理过程。Ross等[2]认为，导致动脉粥样硬化的每一步细胞与分子反应均与炎症密切相关，单核细胞和巨噬细胞起有重要作用。单核细胞粘附、趋化迁入血管内膜是动脉粥样硬化形成的早期事件，而MCP-1是迁入血管内膜的主要细胞因子，主要趋化单核细胞和淋巴细胞，诱导单核细胞、内皮细胞表达粘附分子，使单核细胞等炎性细胞向病变部位聚集，对炎症因子的刺激做出应答，同时活化白细胞介导其产生炎性介质，在动脉粥样硬化形成的早期病变中举足轻重，被认为是反应动脉粥样硬化早期改变与预后的生化指标之一[3-4]。
TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，主要参与炎症反应的级联过程。近年研究发现，TNF-α在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用，它可以通过损伤内皮细胞、促进凝血、抑制纤溶、促进单核细胞对内皮细胞的粘附以及降低血管平滑肌细胞活性等作用，参与动脉粥样硬化发生发展，几乎能完全抑制血管平滑肌细胞表达间质基因，使斑块向不稳定方向发展。其在急性冠脉综合征患者血浆中明显升高[5]。
本研究发现，正常组血管组织不表达或弱表达MCP-1和TNF-α，而模型组、稳消颗粒组和辛伐他汀组的表达均较正常组增强；但模型组表达最为明显，且多定位于泡沫细胞。与模型组比较，稳消颗粒组和辛伐他汀组MCP-1、TNF-α表达的强度及面积均明显减轻(P＜0.01)，提示稳消颗粒、辛伐他汀均可抑制炎症因子MCP-1、TNF-α的表达，利于斑块稳定。研究中还发现，辛伐他汀组较稳消颗粒组抑制炎症因子MCP-1、TNF-α表达似乎更为明显，但差异无统计学意义(P＞0.05)，不知是否与样本量偏小有关，有待扩大样本量后进一步研究。
参考文献
[1] Biasucci LM， Santamaria M， Liuzzo G. Inflammation， atherosclerosis and acute coronary syndromes[J]. Minerva Cardioangiol，2002，50：475－486.
[2] Ross R. Atherosclerosis：an inflammation disease[J]. N Engl J Med，1999，340：115－126.
[3] Lind L. Circulating markers of inflammation and atherosclerosis [J]. Atherosclerosis，2003，169：203－214.
[4] Wada T， Furuichi K， Sakai N， et al. Regulation of monocyte chemoattractant protein 1 in tubulointerstitial lesions of human diabetic nephropathy[J]. Kidney Int，2000，58(4)：1492－1499.
[5] Ridker PM， Rifai N， Pfeffer M， et a1. Elevation of tumor necrosis factor-alpha and increased risk of recurrent coronary events after myocardial infarction[J]. Circulation，2000，101：2149－2153.