作者：龚婕宁，郭海，魏凯峰，董丽霞
【摘要】 目的 探讨养肺活血方对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和核因子κ-B(NFκ-B)表达的影响。方法 大鼠麻醉后，经气管软骨环间隙向心端穿刺，气管内注入博莱霉素A5(5 mg/kg)建立大鼠肺纤维化模型，假手术组大鼠在同样麻醉条件下气管内注入等量生理盐水。术后第2日开始每日灌胃给药，假手术组和模型组予5‰羧甲基纤维素钠(CMC钠)溶液，地塞米松组予等容积地塞米松蒸馏水溶液，各中药治疗组予等容积相应中药合剂，灌胃28 d，麻醉处死大鼠，将左肺固定，包埋切片，常规脱蜡。用免疫组化SABC法检测ERK1/2和NFκ-B的表达；采用光学显微镜和全自动图像获取系统随机测量并计算平均光密度(IOD)值。结果 模型组大鼠肺组织ERK1/2和NFκ-B的表达明显高于假手术组(P＜0.01)。各中药治疗组肺组织ERK1/2和NFκ-B的表达明显低于模型组(P＜0.01)。结论 影响ERK1/2和NFκ-B信号通路可能是中药养肺活血方治疗肺纤维化的机制之一。
【关键词】 肺纤维化；养肺活血方；细胞外信号调节激酶1/2；核因子κ-B；大鼠
Abstract：Objective To study the effect of Yangfei Huoxue Prescription on ERK1/2 and NFκ-B of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods All of rats were randomly pided into seven groups and were intratracheally infused with bleomycin to build the model. Sham operation group and model group were given 5‰ CMC， dexamethasone group was given dexamethasone solution， and each treatment group was given corresponding Chinese medicine mixture. After histological process， the expression of ERK1/2 and NFκ-B were examined by SABC immunohistochemical method. Results Expression of ERK1/2 and NFκ-B in model group were higher than that in sham operation group (P＜0.01). Yangfei Huoxue Prescription could obviously decrease the degree of expression of ERK1/2 and NFκ-B of Bleomycin- induced pulmonary fibrosis in rats (P＜0.01). Conclusions Yangfei Huoxue Prescription can decrease the degree of ERK1/2 and NFκ-B in lung， which may be one of the mechanisms in treating pulmonary fibrosis.
Key words：pulmonary fibrosis；Yangfei Huoxue Prescription；ERK1/2；NFκ-B；rat
肺纤维化是一种发病隐匿、进展迅速、病死率高且治疗效果欠佳的慢性肺部疾患，其病因和发病机制未明。近年来的研究表明，肺纤维化的发生发展与许多致纤维化信号通路的激活密切相关。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径是细胞增殖与分化信号传导的共同通路，是成纤维细胞等许多细胞中多种信号向核内传递的共同途径；核因子κ-B(NFκ-B)是一种多功能的核转录因子，具有广泛的生物活性，在肺纤维化过程中均起到关键性作用[1]。养肺活血方是名老中医王灿晖教授的临床验方，治疗肺纤维化取得了可靠疗效。本研究观察该方对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织ERK1/2和NFκ-B表达的影响，以期深入阐明该方治疗肺纤维化的作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠100只，体重(200±20)g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号0037253。
1.2 药物
活血方由丹参、川芎等组成，按比例称取后，煎制浓缩为含原药材0.35 g/mL的合剂；益气活血方由黄芪、丹参等组成，煎制浓缩为含原药材0.53 g/mL的合剂；养阴活血方由沙参、丹参等组成，煎制浓缩为含原药材0.495 g/mL的合剂；养肺活血方由黄芪、沙参、丹参、川芎等组成，煎制浓缩为含原药材0.675 g/mL的合剂，南京中医药大学中医治法实验室制备，中药饮片由南京药业股份有限公司提供。地塞米松片：0.75 mg/片，批号070403，天津天药药业有限公司生产，用蒸馏水配制成0.000 040 5 g/mL的溶液。博莱霉素A5，天津太河制药有限公司生产，批号070501。
1.3 仪器与试剂
兔抗大鼠ERK1/2和NFκ-B多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片机(德国Leica公司生产)；光学显微镜(日本Olympus公司生产)；全自动图像获取系统Olympus DP71(日本Olympus公司生产)。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠常规适应性饲养3 d后，随机分为7组：假手术组、模型组、地塞米松组、活血组、益气活血组、养阴活血组和养肺活血组，每组14只。
2.2 造模及给药
按文献[2]方法制备肺纤维化大鼠模型。将博莱霉素A5用生理盐水配制成5 mg/mL浓度，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，颈部皮肤消毒，剪去颈部鼠毛，行颈正中切口，分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺注入博莱霉素A5 5 mg/kg，立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，然后缝合皮肤。假手术组在同样麻醉条件下气管内注入等量生理盐水。术后第2日开始每日灌胃给药，假手术组和模型组予5‰羧甲基纤维素钠(CMC钠)溶液1 mL/100 g体重；地塞米松组予等容积地塞米松蒸馏水溶液0.000 405 g/(kg·d)；各中药治疗组予等容积中药合剂，活血组剂量3.5 g/(kg·d)，益气活血组剂量5.3 g/(kg·d)，养阴活血组剂量4.95 g/(kg·d)，养肺活血组剂量6.75 g/(kg·d)。在实验过程中各组均有部分大鼠死亡。
2.3 标本采集
术后28 d，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠后处死，剖取两肺，剪除气管、主支气管，将左肺组织用冰盐水冲洗3遍，滤纸吸干水分，10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，常规脱蜡，用免疫组化SABC法检测ERK1/2和NFκ-B的表达。采用光学显微镜和全自动图像获取系统(Olympus DP71)在高倍镜视野(×400)下随机选取5个区域(视场)，测量并记录每个视野阳性染色的平均光密度(IOD)值，作为该片的代表值。
3 统计学方法
所有数据均以x±s表示，采用SPSS11.5统计软件分析，多组间采用方差分析。
4 结果
(见表1、表2)表1 养肺活血方对博莱霉素致肺纤维化大鼠ERK1/2的影响(略)注：与模型组比较，**P＜0.01；与养肺活血组比较，▲P＜0.05(略)
5 讨论
肺间质纤维化是多种因素参与的多种肺疾病的共同结局，主要病理改变为弥漫性肺泡炎症、细胞外基质的反复修复和过度沉积、肺泡结构紊乱和肺纤维化。其中，细胞因子网络调节紊乱是其主要发病机制。由于涉及的细胞因子很多，不同细胞因子介导的信号传导途径也有差异。在肺纤维化形成过程中，不同细胞因子和不同信号途径相互交错，构成了错综复杂的信号传导体系。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者。MAPK家族在调控细胞生长、发育、分裂及细胞间功能的同步性等多种生理功能中起着重要作用。ERK通路是迄今研究最为透彻的一条MAPK信号转导通路。近年来的研究表明，肺纤维化的发生和发展与许多细胞因子和激酶激活了ERK信号通路密切相关[3]。ERK极可能是多种细胞因子和蛋白激酶作用的交汇点[4]。它既是细胞增殖与分化信号传导的共同通路，也是成纤维细胞等许多细胞中多种信号向核内传递的共同途径。NFκ-B是近年研究较多的核转录因子，它通过调控多种细胞因子、粘附分子、趋化因子、炎症介质、蛋白质酶等基因的转录调控，介导了肺泡炎和肺纤维化。ERK1/2和NFκ-B信号通路在肺纤维化的过程中均起到关键性作用。
我们应用王灿晖教授临床验方“养肺活血方”治疗肺纤维化取得较好疗效，该方由补气、养阴和活血化瘀三类药物组成，方中补气药温而不燥，扶阳而不碍阴；养阴药甘寒清轻，滋而不腻，寒而不滞；活血化瘀药化瘀行血、通利脉道。本实验结果表明，气管内注入博莱霉素A5复制肺纤维化模型后，模型组ERK1/2和NFκ-B表达较假手术组明显升高(P＜0.01)。给药各组的肺组织ERK1/2和NFκ-B的表达明显低于模型组(P＜0.01)。表明养肺活血方治疗肺纤维化的作用机制之一，可能与干预ERK1/2和NFκ-B等信号通路的激活有关。
参考文献
[1] 赵 静，王献华，吴秀珍，等.核因子NFκ-B与肺纤维化[J].中国煤炭工业医学杂志，2006，9(6)：540－542.
[2] Taooka Y， Maeda A， Hiyama K， et al. Effects of neutrophil elastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J]. AM J Respi Crit Care Med，1997，156(1)：260－265.
[3] 徐 芳，徐启勇，叶燕青.ERK信号通路在肺纤维化大鼠中的研究[J].武汉大学学报(医学版)，2005，26(3)：322－325.
[4] 徐 芳，徐启勇，叶燕青.ERK信号通路与肺纤维化中细胞因子相互关系的研究[J].国外医学·呼吸系统分册，2005，25(5)：334－336.