【摘要】 目的 观察雷公藤甲素对胶原诱导型关节炎(CIA)模型小鼠骨与关节破坏的影响。方法 Ⅱ型胶原尾根皮下2次免疫诱导DBA/1小鼠建立CIA模型，第1次免疫后14～42 d，各给药组分别灌服雷公藤甲素(8.18、16.36、32.72 μg/kg)和甲氨蝶呤(0.1 mg/kg)，定期观察临床症状和发病情况，42 d取材，观察组织病理学和放射学变化，并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)对破骨细胞特异性染色后进行TRAP阳性细胞计数。结果 雷公藤甲素能显著降低CIA小鼠的临床积分和发病率，减轻关节滑膜、软骨和骨的组织病理学变化及X光片的骨破坏程度，改善关节间隙，增加膝关节和腰椎骨密度，降低膝关节的骨髓腔和炎性肉芽组织中TRAP阳性细胞的数量。结论 雷公藤甲素对CIA小鼠的关节炎症和骨破坏具有一定的抑制作用。
【关键词】 雷公藤甲素；胶原诱导型关节炎；骨与关节破坏；DBA/1小鼠
Abstract：Objective To observe the effect of triptolide on destruction of bone and joint of collagen- induced arthritis (CIA) mouse. Methods Female DBA/1 mice were double immunized at the base of the tail with bovine type Ⅱ collagen (CⅡ). CIA mice were randomly pided into model group， methotrexate-treated group and 8.18， 16.36， 32.72 μg/kg triptolide-treated groups. Performance of arthritis were observed regularly. Combined with radiological， histological methods were used， and the number of osteoclasts in bone was evaluated and analyzed with TRAP stainning. Results The clinical score and arthritis incidence of CIA mice were significantly decreased， and the number of osteoclasts in bone cavity reduced by treatment of triptolide. X-ray showed that the surface of bone of each articular was eroded， the joint space was narrow， BMD values of lumbar and knee were decreased compared with normal mice. Triptolide could significantly inhibit the damage of bones and joints of CIA mice， and increase the BMD values of lumbar and knee. Conclusion Triptolide can inhibit the damage of bones and joints of CIA mice.
Key words：triptolide；collagen-induced arthritis；damage of bone and joint；DBA/1 mouse
雷公藤系卫矛科植物，临床治疗类风湿性关节炎(RA)疗效确切，被推荐为RA治疗的二线首选药[1]。我们在前期的研究工作中，已通过体内、外实验表明，雷公藤最主要的免疫活性成分雷公藤甲素(triptolide)具有很好的抗滑膜炎症作用和新的软骨保护功效[2-3]。为了进一步了解其阻止病情发展的作用及相关机制，本实验拟采用与人类RA临床特征接近的胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠模型，从整体角度来观察雷公藤甲素对RA骨与关节的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
牛Ⅱ型胶原(CⅡ)购于Chondrex公司(批号070163)；弗
氏完全佐剂购于Difco公司(批号104320JA)；甲氨蝶呤由中国上海信谊药厂生产(批号070604)；雷公藤甲素由福建医学科学院提供；萘酚AS-BI磷酸钠、N，N-二甲基甲酰胺均购于Sigma公司。MCR-6000型高频钼靶乳腺机为意大利Giotto公司产品；乳腺IP和专用乳腺摄影屏-胶系统为Kodak CR-950系统；双能X线骨密度测定仪(DEXA)为美国Norland XR-46。
1.2 动物、分组及给药
SPF级雄性DAB/1小鼠(上海斯莱克试验动物有限公司)，6～8周，体重(20±2)g。小鼠按体重随机分为正常对照组、模型组、甲氨蝶呤组及雷公藤甲素低、中、高剂量组，每组16只。各给药组于第1次免疫后14 d开始口服灌胃给药，每日1次，连续28 d。雷公藤甲素低、中、高剂量分别为8.18、16.36、32.72 μg/kg，甲氨蝶呤剂量为0.1 mg/kg。正常对照组和模型组灌服等体积生理盐水。
1.3 胶原诱导型关节炎模型的建立
参考文献
[4]方法。CⅡ溶于0.1 mol/L醋酸中配成2 mg/mL溶液，再与等量弗氏完全佐剂混合，乳化，取乳化剂按每只小鼠0.1 mg CⅡ的剂量于小鼠尾根部皮下多点注射。第21日采用同样的方法和剂量，激发免疫。1.4 取材及组织处理
第42日将小鼠颈椎脱位处死，用75%酒精浸泡1 min，使用灭菌器械，取膝、踝关节和腰椎(L2～L5)并剥去皮毛，放置4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定，拍X线片和检测骨密度(BMD)，膝、踝关节用10%乙二胺四乙酸二钠盐溶液脱钙，石蜡包埋，常规切片5 μm，苏木素-伊红(HE)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。
1.5 关节炎发病率及疾病严重度评价
参考文献
[5]方法。临床积分：从免疫第18日开始，每日进行1次临床计分，每足4分制，共16分。0分，正常；1分，1～2指(趾)关节肿胀；2分，全足掌的轻度肿胀；3分，全足掌的严重肿胀；4分，整体变形和/或关节僵硬。关节炎发病率：以至少有1只肢体临床积分≥2分以上判断为关节炎发生。1.6 组织病理学积分评价
参考文献
[6-7]方法。选取膝关节和踝关节，从RA病理形态学改变如炎症细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀四方面进行计分。①炎症细胞浸润程度：0分，无浸润；1分，少量存在；2分，稀疏散在；3分，大量存在。②血管翳形成：0分，无血管翳形成；1分，少量血管翳；2分，稀疏散在；3分，大量存在。③关节软骨破坏情况：0分，无破坏；1分，小灶状破坏＜1/3；2分，小灶状破坏＜1/2；3分，小灶状破坏＜2/3；4分，小灶状全部破坏。④骨侵蚀破坏：0分，无破坏；1分，表浅；2分，深达软骨层的1/2；3分，深达全层。1.7 胶原诱导型关节炎小鼠骨质大体形态的评价
1.7.1 后肢关节X光片评价
参考文献
[8-10]方法。由资深放射学医师以双盲法对小鼠的膝、踝和近端指间关节X光片进行阅片，分别从骨侵蚀、关节间隙和骨破坏等级等3个方面评价，具体标准如下。①骨侵蚀：0分，正常；1分，可疑或有1个微小局部病灶；2分，2个局部病灶或病灶总表面积≤50%；3分，3个以上的病灶或病灶总表面积＞50%；4分，关节面完全破坏，或出现骨缩小。②关节间隙：0分，正常；1分，可疑或有一个微小局部病灶；2分，关节出现狭窄；3分，关节强直或关节间隙增宽。③骨破坏：0分，正常；1分，骨质疏松期；2分，骨质破坏期；3分，骨质严重破坏期；4分，强直期。骨侵蚀、关节间隙评分点：膝关节骨侵蚀包括胫骨和股骨共2块，分别积分，累计；膝关节间隙1个，为胫骨和股骨关节间隙。踝关节骨侵蚀共5块骨，包括跟骨、距骨、足舟骨、跖骨和胫骨远端，分别积分，累计；踝关节间隙共2个，包括距骨-足舟骨关节和足舟骨-楔形骨关节，分别积分，累计。近端指间关节共5个，骨侵蚀共10个(近端指骨5个，中间指骨5个)，分别积分，累计。
1.7.2 骨密度的测量
参考文献
[11]方法。采用DEXA(精密度和准确度都为1 %，扫描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，扫描宽度2.0 cm)分别进行腰椎(L2～L5)正位和膝关节侧位BMD的测定，膝关节包括股骨远端和胫骨近端各1.2 cm以及髌骨。1.8 破骨细胞计数
参考文献
[12]方法。取膝关节组织切片，按TRAP染色的实验操作方法，在37 ℃染色20 min。细胞质呈现暗红色的细胞被确认为破骨细胞样细胞。用显微镜在100倍的放大率下，对膝关节的胫骨和股骨两骺板之间的骨髓腔和炎性肉牙组织中TRAP阳性细胞进行计数。1.9 统计学方法
实验结果以x±s表示。软件用SPSS15.0，发病率采用卡方检验，临床积分、病理积分和放射学积分以及破骨细胞计数采用非参数检验。
2 结果
2.1 雷公藤甲素对胶原诱导型关节炎小鼠骨质大体形态的影响
2.1.1 X光片评价情况
X光片结果可见，正常对照组小鼠踝关节面光滑，关节间隙清晰；模型组小鼠踝关节的关节面呈虫蚀样破坏，边缘性骨质侵蚀，伴骨质增生反应，骨端增生、粗大，关节间隙狭窄或增宽，关节相互融合甚至骨性强直；雷公藤甲素各给药组小鼠踝关节面破坏和边缘性骨质侵蚀、关节间隙情况与模型组相比均有不同程度的改善。相关积分结果见表1、图1。 表1 雷公藤甲素对CIA小鼠骨破坏等级积分的影响(略)注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(下同)