白花丹血清指纹图谱的初步研究

【摘要】 目的 对民族药材白花丹进行血清指纹图谱的初步研究，为确定白花丹的药效成分奠定基础。方法 建立白花丹醇提取物、口服白花丹后大鼠含药血清和空白血清的HPLC指纹图谱的分析方法，确定白花丹中的入血成分。结果 在白花丹含药血清中发现了1个入血成分。结论 1个入血成分可能成为白花丹的体内直接作用物质。

【关键词】 白花丹；高效液相色谱法；指纹图谱；血清药物化学

　　Abstract：Objective To sieve the bioactive constituents of Plumbago zeylanica， serum pharmacochemistry research was performed. Method Based on the establishment of HPLC fingerprints of Plumbago zeylanica， the constituents absorbed into blood were determined by comparing the HPLC fingerprints of the methanol extracts， medicated serum samples and blank serum sample. Results One compound absorbed into blood was detected， the other might be metabolites of the original constituent. Conclusion The one onstituent absorbed into blood was possible bioactive component of Plumbago zeylanica.

　　Key words：Plumbago zeylanica L.；HPLC；fingerprint；serum pharmacochemistry

　　白花丹为蓝雪科植物白雪花Plumbago zeylanica L.的全
草或根[1]，为东南亚许多国家及中国多民族常用药材[2]，含有萘醌类、香豆素类、有机酸类及β-谷甾醇等成分。传统的中药药效物质基础研究方法停留在分步提取、药效追踪的体外水平，所确定的活性成分与药效的相关性常缺乏明确的联系。多数现行中药质量标准中所涉及的“有效成分”多为药物的主要成分或指标成分，并无充分依据证明其为有效成分；很多成分即使体外有活性，体内却无明显的作用或不能被吸收，或经代谢后才能产生活性物质。笔者拟采用血清药物化学方法，通过分析口服给药后血清中的移行成分，为最终筛选确定白花丹的药效成分奠定基础。

　　1 材料

　　1.1 仪器

　　美国Waters 1525二元泵高效液相色谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器，Empower数据采集系统；Shim-pack VP-ODS C18色谱柱；Milli-Q超纯水纯化系统(18 MΩ，Millipore公司)；紫外分光光度计(澳大利亚GBC公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯有限公司)；SGT7200HBT型超声清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

　　1.2 药物与试剂

　　白花丹药材由新疆华康药业有限责任公司提供，经新疆维吾尔自治区药物研究所张彦福研究员鉴定为白花丹科白花丹属植物白花丹Plumbago zeylanica L.的地上部分。甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯(美国Tedia试剂公司)，磷酸为色谱纯，水为超纯水。

　　1.3 动物

　　SD大鼠，清洁动物，体质量(250±10)g，雌雄各半，新疆实验动物中心提供；合格证号：SYXK(新)2003-0003。

　　2 方法

　　2.1 液相色谱条件
　　
　　色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流动相：A(乙腈)，B(0.1%磷酸)，梯度洗脱程序见表1，检测波长为270 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。表1 梯度洗脱程序（略）

　　2.2 供试品溶液制备

　　2.2.1 白花丹灌胃液的制备

　　精密称定白花丹粉末(过60目筛)200 g，加90%乙醇加热回流提取3次(溶剂量为药材量的10、8、8倍)，提取时间为2、1、1 h，3次滤液合并，滤液减压浓缩至乙醇完全挥发。精密称定浸膏20 g，0.5%CMC-Na混悬至100 mL制成含药量2 g/mL的混悬液，供灌胃用。

　　2.2.2 白花丹供试液的制备

　　取适量按上述方法制备的白花丹醇提取物(干浸膏)，用甲醇配置成含药量0.1 g/mL，过0.45 μm滤膜，供高效液相色谱(HPLC)分析用。

　　2.2.3 血清样品的采集和处理

　　SD大鼠随机分为给药组和空白组，每组5只。给药组以药液量15 mL/kg灌胃，空白组给予同体积的蒸馏水，每日1次，连续3 d。末次给药后1 h，腹腔注射20%乌拉坦(l mL/100 g)，麻醉后，从腹主动脉取血约5 mL，置于5 mL具塞离心管中，静置30 min后，3 000 r/min离心10 min。用微量移液器吸取同组血清于5 mL具塞离心管中，置于-20 ℃下冷冻保存。行HPLC分析前，用微量移液器吸取血清0.4 mL于2 mL具塞离心管中，加甲醇1.6 mL，充分振摇后，3 000 r/min离心15 min，上清液过0.45 μm滤膜，供HPLC分析用。

　　2.2.4 高效液相色谱分析

　　按液相色谱条件，分别测定白花丹供试液、大鼠含药血清和空白血清。

　　3 结果

　　由图1可见，白花丹醇提物共分离得到9个色谱峰，其中峰面积最大的是7号峰。与空白血清比较，白花丹含药血清出现了1个新色谱峰，即11号峰。比较图1(a，b，c)可知，白花丹含药血清的11号峰与白花丹供试液的7号峰对应，说明有1个白花丹的原型成分吸收入血。而在图1(b，c)中的10号峰与12号峰相对应，是血清中的固有成分。

　　4 讨论

　　笔者分别采用不同醇浓度提取制备白花丹供试液。通过比较发现，90%乙醇对提取白花丹中的化学成分有较好的分离效果。因此，采用90%醇提取法制备白花丹供试液。同时，对供试液的稳定性、仪器的精密度和测定方法的重复性进行了考察，均符合相关要求。

　　试验中分别采用甲醇沉淀法、热水浴法及高氯酸钾沉淀法对血清样品进行处理，从对待测组分的影响、干扰情况及对色谱分析条件的影响等方面进行考察，确定采用甲醇沉淀法处理血清样品。

　　在白花丹醇提物和含药血清色谱图中，7号峰与11号峰位置相对应，可以确定该色谱峰是白花丹入血成分，有可能成为白花丹体内直接作用物质，有待采用质谱检测等方法做进一步考察。

参考文献