作者:陈业农,王键,唐巍,胡建鹏
【摘要】 目的 观察益气活血治法代表中药复方脑络欣通及其拆方(益气方、活血方)对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠室下区(SVZ)神经干细胞增殖的影响。方法 采用线栓大脑中动脉法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,分别观察益气活血、益气、活血3种治法及其代表方药在缺血2 h后,分别再灌注1、3、7 d的治疗效果;免疫组化染色SABC法检测神经上皮干细胞蛋白巢蛋白表达。结果 各治疗组巢蛋白表达增加,但仅在缺血再灌注7 d时与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05);益气活血法组表达明显增加,在缺血再灌注7 d时与益气法组和活血法组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。结论 经过脑络欣通(益气活血法)及其拆方(益气方、活血方)干预后,可使内源性神经干细胞的增殖明显增加,脑络欣通在促进神经干细胞增殖(7 d)表达的效应上要优于其拆方(益气方、活血方)。
【关键词】 脑络欣通;局灶脑缺血再灌注;神经干细胞;巢蛋白增殖
Key words:Naoluoxintong;local cerebral ischemia-reperfusion;neural stem cells;Nestin proliferation
本实验选用局灶性脑缺血再灌注模型大鼠,观察脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注后巢蛋白蛋白表达的影响,探讨脑络欣通对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠神经干细胞(NSCs)增殖、分化影响的规律;着眼于中医药诱导内源性NSCs增殖、分化,从而探索出一条新的神经功能重建的干预调节机制。
1 实验材料
1.1 动物及分组
健康Wistar大鼠120只,雌雄各半,体重280~320 g,河南医科大学实验动物中心提供(合格证号:YU-A-4100112)。实验前先饲养观察3 d。将120只动物随机分为假手术组、模型组、益气活血组(脑络欣通组)、益气药组和活血药组共5组,每组24只,1、3、7 d 不同时间点各8只。
1.2 主要药物及试剂
益气药由黄芪组成,活血药由三七、川芎等组成;脑络欣通由益气药和活血药组成。全部药物购自安徽中医学院第一附属医院中药房,安徽中医学院中药制剂室提供制剂。免疫组化染色SABC试剂盒、DAB显色剂、APES均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 主要仪器
FA2004型电子天平(上海天平仪器厂生产);101-A恒温干燥箱(宁波自动化仪表厂);TB-718自动石蜡包埋机(泰维电子设备有限公司);LEICA-ASP200自动切片机(LEICA公司);OLYMPUS-VANOX显微镜(日本OLYMPUS光学工业株式会社); DP801形态学显微图像分析系统(南京捷达科技发展有限公司)。
2 实验方法
2.1 造模
参考Koizumi[1]法制作急性局灶性脑缺血动物模型。简要手术步骤如下:10%水合氯醛溶液(350 mL/kg)腹腔注射麻醉仰卧固定动物,备皮、消毒、作颈部正中切口,由颈总动脉分叉处向头端依次游离,电凝颈外动脉所有分支,切断颈外动脉,使其主干游离备用;用微型无损动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉,剪刀在颈外动脉残端作一“V”形切口,将预先制备好头端涂有聚氨酯的线拴快速插入颈内动脉约(18.0±0.5)mm(至感觉有少许阻力为止),清理术野,全层缝合,关闭切口;阻塞时间为2 h,再灌注时将栓线抽出约10 mm,拔线时稍有脱空感即止,将远端剪断约10 mm,以防动物苏醒后将栓线抓脱,导致大出血死亡。
参考Longa[2]法于缺血2 h及再灌注1、3、7 d进行神经功能缺损体征评分。通过神经功能评分判断脑缺血模型的成功与否,2~3分为入选动物。
模型制备完成后大鼠虽然有脑缺血症状,但伴下列情形之一者不纳入:①神经学症状评分低于2分者;②取脑时发现蛛网膜下腔出血者;③脑组织冰冻切片HE染色无缺血病理改变者;④未到观察时间点便死亡者。凡因上述因素导致各实验组动物数不足预定数量者通过随机抽样原则补齐。
2.2 给药
脑络欣通、益气药、活血药均由安徽中医学院中药制剂室制成汤剂,分别相当于原药材2.25、3.75、6 g/mL。按以往药效学实验结果[3],取最佳剂量,分别按每日3.5、5.04、8.54 g/kg灌胃。在制作局灶性脑缺血模型成功后30 min给药1次,以后每日早晚各1次。假手术组、模型组按同样方法予以等量生理盐水灌胃。
2.3 组织处理
在各个相应的时间位点前,以10%水合氯醛(350 mL/kg)腹腔注射麻醉动物,然后打开胸腔,于右心耳部剪一小口,从左心室插入导管至主动脉,向内迅速注入37 ℃肝素化生理盐水约200 mL,至右心耳流出液变清亮,然后注入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液约350 mL,灌流固定30 min后断头取脑,除去小脑和脑干,取缺血侧半脑,从视交叉处冠状面切开后放入相同的固定液中固定1周,脱水、透明、浸蜡,制作脑部冠状切片。
2.4 巢蛋白免疫组化染色及观察
按试剂盒说明操作,采用免疫组化SABC法,阴性对照采用正常山羊血清替代第一抗体进行,每个时间段做8只大鼠,在视交叉后连续切8张冠状切片。根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法[4],用DP801图像分析系统,于额顶叶皮质或相近部位同倍(×400)的7个不同视野,统计每个视野下巢蛋白的平均光密度、阳性细胞总面积,分别取平均值。
2.5 统计学方法
数据用x±s表示,用SPSS11.0统计软件处理,采用方差分析和t检验。
3 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠不同时点巢蛋白阳性细胞总面积比较(略)注:与假手术组比较,△P&<0.05,△△P&<0.01;与模型组比较,▲P&<0.05;与益气活血组比较,#P&<0.05(下同) 表2 各组大鼠不同时点巢蛋白阳性细胞平均光密度比较(略)
4 讨论
神经上皮干细胞蛋白巢蛋白是一种中间丝蛋白,属第Ⅵ类,是NSCs常用的分子标记物。传统观点认为,中枢神经系统在出生后不久就停止发育,成年脑缺乏产生神经元和重建神经网络的内部机制以应对急性损伤和神经退行性疾病[5]。然而,近来越来越多证据表明,哺乳动物中枢神经系统有产生新神经元和修复受损区的能力,中枢神经系统这种能力与脑内的NSCs是分不开的[6]。NSCs是一种具有自我增殖和分化产生神经元、胶质细胞能力的细胞群,特异性表达为巢蛋白抗原阳性。正常情况下,它们以静止、不增殖状态存在,并受生长因子、神经递质、周围细胞等微环境调控。当脑组织病变、微环境改变时,NSCs被激活而有代偿和修复作用。正是由于NSCs具有自我增殖和分化的潜能,因此可以通过强化脑缺血后内源性NSCs的神经再生,实现大脑的自我修复。
大量研究证实,成年人及哺乳动物脑存在NSCs,脑缺血可诱导这些NSCs的增殖、迁移并分化为神经元和胶质细胞[7-8],并可促进相应脑区表达胚胎期巢蛋白。本实验发现,模型组在未加任何干预的情况下,于造模后1、3、7 d巢蛋白阳性细胞表达有增高趋势,7 d达到高峰,说明缺血性脑损伤后,脑组织存在可塑性,能进行自我修复,其自我修复的能力主要表现在1、3、7 d时巢蛋白表达的阳性面积和平均光密度,与假手术组比较有有统计学意义 (P&<0.01);各治疗组Nestin阳性染色的阳性细胞表达增加,与模型组比较其阳性面积和平均光密度7 d差异有统计学意义(P&<0.05);益气活血组与益气组和活血组比较于7 d时巢蛋白表达明显增加,其阳性面积和平均光密度差异有统计学意义(P&<0.05)。各治疗组在不同时相上巢蛋白的表达也呈现出与模型组基本一致的变化趋势,其突出表现在7 d时,各治疗组巢蛋白阳性染色的阳性细胞表达明显增加,但益气活血组的表达效应要优于益气组和活血组。
中医理论认为,气血是脑生长发育和产生各种功能活动的物质基础,气虚血瘀是缺血性中风的主要病机之一,由于脑的气血渗灌不足,致气血运行不畅,无以充养脑髓。中医范畴的“脑髓”广义上应涵盖NSCs、神经祖细胞、神经元、神经胶质细胞、基质细胞、胞外基质等基本结构与功能单位,狭义上含有NSCs的脑组织可称之为“脑髓”。因此,针对缺血性中风“气虚血瘀”病机特点,我们应用具有益气活血功效的脑络欣通,使气盛而脉络通利,恢复脑之气血供养,体现了理法方药整体观以及以补为通(益气扶正以帅血),以通助补(活血通脉以复旧、载气),益气和活血交互作用、彼此协同的过程。实验发现,脑络欣通和益气药、活血药均能不同程度的促进巢蛋白表达,但脑络欣通比单纯使用益气药或活血药总体作用效果好,在部分时段有显著差异。我们知道,在神经胚发育过程中,巢蛋白的表达从某种意义上增加了NSCs的抵抗力和适应性,巢蛋白很可能是一种自我保护性蛋白。当中枢神经系统受损伤时,巢蛋白的重新表达可能增加细胞抗损伤的能力,有利于损伤灶的修复[9]。含有巢蛋白的细胞骨架在神经发育过程中可能增加神经细胞的弹性和伸缩性,这对于NSCs的增殖具有重要作用[10]。本实验证实,脑缺血后出现巢蛋白表达且7 d时各治疗组可明显增强这种趋势,而神经细胞的可塑性与细胞骨架蛋白的弹性和伸缩性有关,因此推断脑缺血后7 d时,各治疗组对其显著的促进作用可能与巢蛋白表达细胞参与了神经可塑性和突触重构有关,但促进巢蛋白表达的确切机制尚不清楚,还有待于今后的进一步探讨。本实验结果初步显示,大鼠局灶性脑缺血后在相应时段,各治疗组可以使与神经系统生长发育及神经可塑性有关的巢蛋白的表达保持在较高水平,促进神经细胞的代偿性修复,减轻神经功能缺损程度,提示脑络欣通在促进脑缺血后的巢蛋白表达上调,可能为治疗缺血性中风的重要作用机制之一。
参考文献
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注:本实验在安徽中医学院针灸基础与技术重点实验室培育基地及安徽中医学院科研实验中心完成。