作者：程烜，马小明，张敏思，游志红，姚双吉，杨雨旸
【摘要】 目的 观察牡芍合剂对骨折术后疼痛模型大鼠丘脑中β-内啡肽(β-EP)及八肽胆囊收缩素(CCK-8)的影响，探讨牡芍合剂的镇痛机理。方法 选取体重250～300 g SPF级雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组(空白组)、模型组、牡芍合剂治疗组和曲马多对照组，采用Brennan术后痛模型，术后曲马多对照组、牡芍合剂治疗组立即给药，给药后1 h处死动物取脊髓，采用放射免疫法测定β-EP及CCK-8的含量。结果 与模型组相比，牡芍合剂能显著升高术后疼痛模型大鼠丘脑中β-EP含量，并降低CCK-8的含量。结论 牡芍合剂可以促进β-EP的分泌，抑制CCK-8的分泌，起到镇痛作用。
【关键词】 牡芍合剂；术后痛模型；β-内啡肽；八肽胆囊收缩素
Key words：Mushao composition；pain after operation model；β-EP；CCK-8
创伤骨科肢体手术，特别是端肢(指)再植等显微外科手术，术后良好的镇痛可缓解骨骼肌和微小动静脉血管的痉挛，避免高凝的出现及血栓的形成，有利于手术的成功和患者的康复。近3年来，甘肃省中医院将牡芍合剂运用于骨科手术后疼痛的患者，该药治疗骨折及术后疼痛从“心”入手，通过镇静安神以调和逆乱之气血，从而达到镇痛之效果，临床取得了良好的效果。该药药效学的研究也显示，其能明显抑制醋酸引起的小鼠扭体次数，延长小鼠热刺激引起的痛反应时间。为了进一步探讨该药的镇痛机理，我们开展了该药镇痛机理的初步实验研究。
1 实验材料
1.1 药物
牡芍合剂由甘肃省中医院制剂室提供，批号20060526。盐酸曲马多缓释片，华北制药集团制剂有限公司提供，批号20050310。2%异氟烷，英国罗地亚精细化工有限公司产品，批号51C05A。
1.2 动物
SPF级Wistar大鼠，雄性，96只，体重250～300 g，甘肃中医学院科研实验中心提供，合格证号：SYXK(甘)2004-0006。
1.3 仪器及试剂
全自动γ免疫计数仪(FJ-2008型，西安二六二厂生产)；电子分析天平(JY4001型，上海精科公司天平仪器厂生产)；低温高速离心机(KDC-2044型，科大创新股份有限公司中佳分公司生产)；可控低温冰箱(BCD-183型，青岛奥柯玛公司生产)；β-内啡肽(β-EP)、八肽胆囊收缩素(CCK-8)放免试剂盒，第二军医大学神经生产教研室提供。
2 实验方法
2.1 分组
健康SPF级Wistar雄性大鼠32只，随机分为正常对照组、模型组、牡芍合剂治疗组和曲马多对照组，每组8只。
2.2 模型制备
采用Brennan术后痛模型。于正式实验开始前3 d，用脱毛剂(8%硫化钠)脱去大鼠左侧膝关节以下的毛。在放有脱脂棉的小烧杯中倒入10 mL的2%异氟烷，并马上将小烧杯放入标本缸，将大鼠投入，盖严标本缸，待鼠意识丧失，肌肉松弛后取出，用血管钳折断左后肢胫骨，在骨折局部用2%络合碘消毒皮肤，然后在其骨折处内侧做一手术切口，长约1 cm，依次切开皮肤、筋膜，分离肌肉直至骨面，向两侧分离肌肉，显露骨折断端，明确骨折后，将皮肤缝合一至两针，让大鼠自然苏醒。正常对照组不做处理。模型成功的标志是大鼠活动量明显减少，行走患肢不敢负重，进食量减少，出现完全提起、舔、咬被刺激肢体，毛色黯淡无光泽，经测定痛阈明显减低。
2.3 给药
正常对照组：生理盐水灌胃，剂量为5 mL/(kg·d)；模型组：生理盐水灌胃，剂量为5 mL/(kg·d)；牡芍合剂治疗组：每次牡芍合剂0.9 g/(kg·d)灌胃，每毫升牡芍合剂相当于原药材1.04 g；曲马多对照组：每次曲马多0.135 g/(kg·d)灌胃。均在术后麻醉清醒后开始灌胃给药1次。
2.4 指标检测
2.4.1 标本采集和处理
给药后1 h，动物在吸入2%安氟烷10 min后，迅速取出大脑，在生理盐水中煮沸5 min，称重(取下丘脑100 mg)后，置于玻璃匀浆管内，加入 1 mol/L 醋酸1 mL，在冰浴中充分匀浆后转入到塑料试管中，室温放置100 min。加入1 mol/L 氢氧化钠0.8～1 mL，中和酸。4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清-20 ℃保存待测。
2.4.2 β-内啡肽、八肽胆囊收缩素的测定
采用放免法检测丘脑中β-EP、CCK-8的含量，利用均相竞争抑制原理，具体方法严格按照试剂盒说明书操作，兰州大学第一附属医院核医学科专人协助检测。
2.5 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件分析，采用方差分析(ANOVA)，α＝0.05为检验水准，P≤0.05为有统计学意义，结果以x±s表示。
转贴于3 结果
(见表1)表1 牡芍合剂对术后痛模型大鼠丘脑中β-EP、CCK-8含量的影响(略)注：与空白组比较，▲P&<0.01；与模型组比较，*P&<0.01
4 讨论
术后疼痛是手术创伤、刺激直接或间接作用于神经末梢，导致大量的局部致痛物质(前列腺素、血清素、组织胺、缓激肽、P物质)释放，引起血管舒张和通透性增高等炎症反应，随即发生痛觉敏感，进而影响循环呼吸功能及内分泌、代谢等改变，如处理不及时，可发生呼吸功能不全、心肌梗死、休克、心理障碍等并发症，影响手术效果及术后恢复[1]。术后疼痛之病机关键是气血运行失调、脉络绌急、心神不宁。牡芍合剂具有镇静安神、痛络止痛功效。本实验以雄性术后疼痛大鼠为动物模型，探讨了其镇痛的作用机制。
内源性阿片肽(EOP)以β-EP、亮脑啡肽(LEK)等为代表。β-EP作为内啡肽家族前体前阿黑皮(POMC)的单拷贝阿片肽，是POMC中唯一存在的阿片肽序列，下丘脑含量较高[2]。同时，β-EP的生理作用也十分广泛，其最大的特性就是在哺乳动物中有缓解疼痛的能力[3]。其机制为与细胞膜上阿片受体结合，然后通过由此导致的细胞内信号传导途径发挥作用。这些途径包括两个方面：①激活的阿片受体与细胞膜上的抑制型G蛋白结合，从而导致抑制腺苷酸环化酶，使cAMP含量降低，降低细胞兴奋性；抑制磷脂酰肌醇(PI)水解为二酰甘油和三磷酸肌酐，使磷脂酶C活性下降并抑制Ca2+通道。②阿片受体与各种离子通道相偶联：L、D和J受体通过激活K+通道，抑制Ca2+通道，从而抑制神经元的兴奋性；而以胆囊收缩素为代表的抗阿片肽则不同程度的对抗它们的作用。通过对阿片肽与抗阿片肽相互作用的研究已经发现，中枢神经系统中阿片和抗阿片这一对矛盾是主宰阿片镇痛效果优劣的决定性因素之一[4]。某些神经递质在中枢神经系统内能够对抗阿片类物质的某些功能，被称为抗阿片物质。CCK-8是目前已知的作用最强的抗阿片物质[5]。体内阿片物质过多时，将引起抗阿片肽CCK-8的生成和释放增多，引起负反馈调节作用[6]。外源性和内源性阿片物质均可促进中枢释放CCK-8，并促进CCK-8基因表达和生物合成[7]。灌服牡芍合剂后骨折大鼠下丘脑组织中β-EP含量增高，CCK-8含量明显降低，β-EP含量的增高标志着内源性镇痛活动的开始，提示牡芍合剂对大鼠术后痛的治疗作用与中枢镇痛机制有关，但其是通过何种途径刺激机体中枢阿片和抗阿片物质的合成释放或减少释放的，还有待于进一步研究。
参考文献
1] 韩济生.神经科学原理[M].第2版.北京：北京医科大学出版社，1999. 706－728.
[2] Pogatzki， Esther M. A mouse model of incisional pain. anesthesiology， 2003，99(4)：1023－1027.
[3] Editorial. Advances in pain[J]. British Journal of Anaesthesia， 2001，87(1)：1－2.
[4] Zanardo V， Nicolussi S， Carlo G， et al. Beta endorphin concentrations in human milk[J]. J Pediatr castroenterol nutr， 2001，33(2)：160－164.
[5] 韩济生.中枢阿片肽和胆囊收缩素功能活动的消长是决定针刺镇痛有效性的重要因素[J].北京医科大学学报，1996，28(5)：321－326.
[6] 韩济生.中枢八肽胆囊收缩素的抗阿片作用是决定针刺镇痛和吗啡镇痛有效性的重要因素[J].生理科学进展，2000，31(2)：173－177.
[7] Zhou Y， Sun YH， Zhang ZW， et al. Increased release of immunoreactive CCK-8 by morphine and potentiation of μ opioid analgesia by CCK-8 receptor antagonist L 365，260 in rat spinal cord[J]. Eur J Pharmacol，1993，234：147－152.