【摘要】 目的 观察参地糖脉宁对糖尿病大鼠外周血T淋巴细胞及其细胞因子和免疫器官系数的影响。方法 将48只雄性SD大鼠随机分为糖尿病组(DM组)、糖尿病阿司匹林干预组(AD组)、糖尿病参地糖脉宁干预组(SD组)、对照组(NC组)。流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+ T细胞计数，酶联免疫吸附双抗体夹法(ELISA)测定各组大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)，测定并计算免疫器官系数。结果 DM组CD3+、CD4+、CD8+ T细胞和胸腺指数显著低于NC组(P&<0.01)，而IL-6和TNF-α显著高于NC组(P&<0.01)；SD组和AD组的CD3+、CD4+、CD8+ T细胞和胸腺指数显著高于DM组(P&<0.05)，TNF-α和IL-6显著低于DM组(P&<0.01)；与AD组比较，SD组上述指标有明显改善(P&<0.05)。结论 参地糖脉宁对糖尿病大鼠免疫系统有保护作用。
【关键词】 糖尿病；阿司匹林；参地糖脉宁；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6；大鼠
Key words：diabetes；aspirin；Shendi Tangmaining；TNF-α；IL-6；rat
1型糖尿病是在一定遗传因素的基础上，由于环境因子的刺激，有T淋巴细胞参与介导的胰岛β细胞损害而导致的胰岛素分泌不足的慢性自身免疫性疾病[1]。在糖尿病的发生及发展中，T细胞亚群及其细胞因子起重要作用，同时糖尿病亦影响T细胞亚群及其细胞因子功能。本研究用参地糖脉宁对糖尿病大鼠进行灌胃处理，并以阿司匹林灌胃作为干预对照，观察糖尿病大鼠免疫系统的变化及参地糖脉宁对实验性糖尿病大鼠免疫系统的保护机制。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂及药物
选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，体重190～210 g (苏州大学实验动物中心提供)，血糖正常。链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸三钠、柠檬酸为美国Sigma公司产品。红细胞裂解液、小鼠抗大鼠CD3+ FITC、小鼠抗大鼠CD4+ R-PE、小鼠抗大鼠CD8+ R-PE为Caltag公司产品。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测定ELISA
试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)测定ELISA试剂盒为美国Biosource公司产品。参地糖脉宁溶液由苏州市立医院内分泌科提供。阿司匹林为南京白敬宇制药有限公司产品。
1.2 造模、分组与给药
正常SD大鼠适应性喂养7 d，禁食不禁水12 h后，腹腔内注射STZ 60 mg/kg。STZ腹腔注射72 h后取血，血糖≥13.9 mmoL/L连续3 d者为糖尿病模型。糖尿病模型大鼠分为糖尿病组(DM组)、糖尿病阿司匹林干预组(AD组)、糖尿病参地糖脉宁干预组(SD组)。另有鼠龄和体重相似的雄性SD大鼠作为对照组(NC组)，每组12 只。NC组注射等量的枸橼酸缓冲液。模型建立1周后，AD组予阿司匹林30 mg/(kg·d)灌胃，SD组予参地糖脉宁溶液5 g/(kg·d)灌胃，DM组与NC组予等量的蒸馏水灌胃，饲养12周结束实验。
1.3 样本获取
用药前及用药12周后用毛细玻璃管从内眦静脉取血2 mL，用肝素抗凝，用于外周血CD3+、CD4+、CD8+ T细胞测定；次日用毛细玻璃管从内眦静脉取血2 mL，离心分离血清，置-70 ℃保存，用于TNF-α和IL-6的测定。灌胃12周后，大鼠称重，脱颈椎处死解剖，取出胸腺，滤纸吸干血迹后称重。
1.4 指标测定
1.4.1 外周血CD3+、CD4+、CD8+ T细胞测定
测定管加入萤光标记的抗体50 μL；再加入肝素抗凝全血50 μL，混匀；避光，室温，孵育15 min；加入50 μL溶血剂，溶血；PBS洗涤1次；0.5～1 mL PBS重悬细胞，上机检测。
1.4.2 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的测定 采用ELISA法。2 h测定450 nm吸光度。
1.4.3 免疫器官系数的测定
免疫器官系数＝器官重量(mg)/体重(g)。
1.5 统计学方法
实验数据采用SPSS10.O软件进行分析，所有数值用x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
(见表1～表3)表1 各组大鼠用药前后外周血CD3+、CD4+、CD8+ T细胞计数和CD4+/CD8+比值比较(略)注：与NC组用药前比较(略)，★P&<0.O5，★★P&<0.O1；与NC组用药后比较，▲P&<0.O5，▲▲P&<0.O1；与DM组用药后比较，#P&<0.O5，##P&<0.O1(下同)表2 各组大鼠用药前后血清TNF-α和IL-6水平比较(略)表3 各组大鼠用药后免疫器官系数比较(略)
3 讨论
T淋巴细胞是机体最重要的免疫细胞群，根据细胞表面分子(CD)分为CD4+和CD8+两大亚群；按功能分为辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和抑制性T细胞。T细胞抗原受体(TCR)与CD3分子结合形成TCR-CD3复合物，具有识别和结合抗原以及传导信号功能。CD3+ T细胞代表成熟总T淋巴细胞水平，CD3+细胞下降表示成熟总T淋巴细胞减少，细胞免疫功能减弱；CD4+代表辅助性T细胞，参与TCR识别特异性抗原肽-MHCⅡ类分子复合物及信号转导；CD8+代表抑制和细胞毒性T细胞，参与TCR识别特异性抗原肽-MHCⅠ类分子复合物及信号转导；CD4+/CD8+细胞比值的动态平衡，维持机体正常免疫应答。一般认为，循环中总淋巴细胞(CD3+)减少及CD4+、CD8+ T细胞降低是免疫缺陷的重要特征[2]。众多研究证明，糖尿病机体免疫力明显下降，特别是细胞免疫功能下降明显，易于感染。并发感染是糖尿病常见而又是其致死的原因之一。研究发现，在糖尿病合并感染组患者血清中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较糖尿病非并发感染组明显降低[3]。本实验亦发现，造模成功12周后，DM组CD3+、CD4+、CD8+ T细胞较NC组明显降低。CD3+细胞百分率下降表示成熟T淋巴细胞减少，从而导致细胞免疫功能减弱，机体易感染。同时，高血糖引发的一系列代谢改变引起免疫功能下降，比如NK细胞活性下降等。况且高血糖使血浆渗透压升高，导致粒细胞的趋化性、吞噬作用及自卫能力降低，并抑制白细胞杀伤作用，使抗体生成减少等，造成机体抵抗力降低而易于感染[4]。TNF-α主要由单核细胞和内皮细胞产生，正常情况下低水平的TNF-α可起到生长因子的作用，调节炎症反应及促进组织修复。然而，异常增高的TNF-α对糖尿病的发展和并发症的发生有重要作用[5]。IL-6是一种多功能的生物性细胞因子，可由B细胞、T细胞、单核细胞等多种细胞产生，在免疫和炎症反应中发挥重要作用。本实验发现，糖尿病模型大鼠用药前，TNF-α和IL-6在DM组、AD组、SD组较NC组明显升高(P&<0.01)；随着糖尿病的发展，DM组TNF-α和IL-6不断增高，较AD组、SD组差异有统计学意义(P&<0.01)。
参地糖脉宁含有丹参、生地黄、大黄、川芎等中药，主要成分有蒽醌类、大黄素、大黄酸、川芎嗪和丹参酮等。实验研究表明，大黄具有提高免疫力作用，降低机体的补体活性，减少过多的补体对机体的病理损害；可促进脾淋巴细胞增殖，提高机体的免疫功能；增强NK细胞杀伤靶细胞的能力[6]；川芎嗪在机体细胞免疫、体液免疫与非特异性免疫等方面也有较好的促进作用[7]；丹参和生地黄能调节细胞因子，减少免疫复合物以及补体方面作用[8-9]。本实验数据表明，SD组大鼠经过12周的治疗，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞分别较用药前和DM组、AD组有明显增高；同时，SD组TNF-α和IL-6较用药前和DM组、AD组明显降低。SD组大鼠状态良好，血糖亦较低。可能因为其主要成分蒽醌，抑制细胞DNA的合成而降低不同丝裂原对脾脏淋巴细胞诱导刺激和免疫因子的产生，抑制巨噬细胞分泌细胞因子，对糖尿病机体起到保护作用。
参考文献
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