作者：阎醒予 柴瑞华 单德红
【摘要】 ：目的 围绕海马结构的形态学研究定志小丸的抗抑郁机制。方法 40只雌性大鼠分为对照组、抑郁症模型组(模型组)、蒸馏水组(DW组)和定志小丸组(中药组)，Open field法检测行为学得分，ELISA法检测血清皮质醇和雌二醇(E2)含量，HE染色和电镜技术观察海马CA3区神经元形态，免疫组化技术检测齿状回神经干细胞(NSC)增殖。结果 与对照组比较，模型组和DW组行为学得分及血清E2含量显著下降，皮质醇水平升高和NSC增殖明显降低，海马CA3区神经元损伤明显；中药组行为学得分和血清E2含量无明显变化，皮质醇明显减少，NSC增殖显著增加，海马CA3区神经元基本正常。结论 定志小丸能够保护海马结构，这可能是其抗抑郁机制之一。
【关键词】 抑郁症 定志小丸 雌二醇 神经干细胞 皮质醇 大鼠
Abstract：Objective To study the anti-depression mechanism of Dingzhixiaowan concerning on histology of hippocampal formation. Methods 40 female rats were pided into control， depression model group (model group)， distilled water group (DW group) and Dingzhixiaowan group (Chinese herb group). Behavior points were measured by open field method. Serum concentrations of cortisol and estradiol (E2) were checked with ELISA. HE staining and electron microscopy were applied to observe the histology of neurons in hippocampal formation. Immunohistochemistry method was employed to detect Nestin expression. Results Compared with the control， behavior points， serum E2 level and Nestin expression decreased obviously and serum cortisol level increased markedly， CA3 neurons were seriously damaged in model and DW groups. While behavior points， serum E2 level did not change， Nestin expression increased obviously and serum cortisol level decreased markedly， CA3 neurons were basically normal in Chinese herb groups. Conclusion Dingzhixiaowan can protect hippocampal formation， which might be one of the anti-depression mechnisms.
Key words：depression；Dingzhixiaowan；estradiol；neural stem cell；cortisol；rat
目前认为，慢性应激刺激造成的海马结构损伤是抑郁症发病的主要原因。对海马结构来说，糖皮质激素是损伤激素，雌激素为保护激素，而女性的雌激素水平变化较大，其保护作用时常减弱，这可能是女性抑郁症发病率较高的原因。本研究以此为出发点，研究定志小丸的抗抑郁机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
成年Wistar雌性大鼠(230±20)g，辽宁中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(辽)2004-0018。适应性饲养1周后，选择体重和行为学得分相近的40只大鼠，随机分为对照组、模型组、蒸馏水组(DW组)和定志小丸组(中药组)，每组10只。对照组每笼5只饲养，其余3组每笼1只饲养。
1.2 抑郁症模型的建立
除对照组外，其余3组动物均接受慢性应激刺激，复制慢性不可预见性应激模型。其方法是：在21 d内施加电击足底(36 V交流电，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、摇晃(1 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)等刺激，每种刺激3～4次。
1.3 给药
对照组不给药；模型组只施加灌胃动作；DW组灌服1 mL蒸馏水；中药组灌服定志小丸。定志小丸为人参、茯苓、远志、石菖蒲的标准提取物(购于安徽宣城百草生物有限公司，提纯比例为5∶1)，剂量分别是10、10、6、6 g，溶于适量水中，加热后浓缩为1 kg/L。按成人用量折算成灌胃剂量[1 mL/100(g? d)]，于刺激前1 h灌服。
1.4 大鼠行为学检测
采用Open field法检测，以3 min内大鼠水平穿越方格数作为水平活动得分，以前肢抬起次数为垂直活动得分。检测过程中保证时间、光照、温度及环境噪音的一致性。检测由3人同时完成，1人负责计时，1人负责观察大鼠的水平活动，1人负责计数垂直活动。正式检测前，3人首先熟悉检测标准，并进行多次训练，尽量减少人为误差。
1.5 血清皮质醇和雌二醇检测
在第22天，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主动脉取血，离心后取血清，冻存备用。于沈阳军区总医院内分泌实验室采用ELISA方法检测血清皮质醇和雌二醇(E2)含量。
1.6 海马组织学观察
将取血后的大鼠用150 mL生理盐水经主动脉快速冲洗，取一侧海马行常规HE染色，另一侧于扫描电镜下观察形态学变化。
1.7 齿状回神经干细胞(NSC)增殖检测
采用Nestin免疫组化方法，取经生理盐水快速冲洗后的海马，4%多聚甲醛固定4～6 h，30%蔗糖溶液沉底。冰冻连续切片，片厚25 μm，隔4片取1片。将切片置含新鲜0.5% h3O2的纯甲醇中30 min；0.1% Triton溶液中30 min；正常山羊血清60 min；兔抗鼠Nestin一抗(1∶2000，Sigma)，25 ℃孵育1 h，4 ℃过夜；生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗试剂盒)，室温下60 min；SABC复合物，室温60 min；DAB显色(博士德)。染色对照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步骤同上。利用BI-2000医学图像分析系统，计数阳性细胞数。
1.8 统计学方法
实验数据以x±s表示，采用SPSS11.5进行统计处理。
2 结果
2.1 各组大鼠海马CA3区神经元的形态学变化
光镜下可见，对照组CA3区有大量致密锥体细胞，排列整齐，细胞完整，边缘清晰，死亡细胞较少；模型组和DW组可见细胞层次减少、紊乱、中断，大量细胞坏死；中药组神经元形态与对照组基本接近。电镜下可见，对照组细胞器丰富，轮廓清晰，细胞核呈圆形，核膜清晰光滑完整，核染色质分布均匀；模型组和DW组细胞器减少，线粒体空泡化，细胞核变小，不规则，且核膜增厚，核周电子密度降低；中药组与对照组基本相同。
2.2 各组大鼠齿状回Nestin表达
镜下可见Nestin免疫阳性反应产物呈棕黄色，环形分布于核膜周围。对照组镜下可见较多的棕黄色反应物，边缘相对清晰，细胞大小相近；模型组和DW组棕黄色反应物较少，边缘不清，细胞大小不一致；中药组镜下可见大量棕黄色反应物，边缘清晰，细胞大小一致。各组Nestin阳性细胞数见表1。表1 各组大鼠Nestin阳性细胞数(略)注：与对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01(下同)
2.3 各组大鼠行为学得分
(见表2)表2 各组大鼠的行为学得分(略)注：与本组第0天比较，△△P&<0.01
2.4 各组大鼠血清皮质醇和雌二醇含量
(见表3)表3 各组大鼠血清皮质醇和雌二醇含量变化(略)
3 讨论
海马结构具有调节内脏功能、情绪和行为的多种作用，主要由海马和齿状回组成。齿状回存在NSC，能够增殖、迁移至海马CA3区，分化形成新的神经细胞。因为抑制齿状回NSC增殖后，许多抗抑郁药物会失效，所以，海马CA3与齿状回的关系在抑郁症发病中的作用逐渐受到重视。抑郁症的发病机制目前认为是慢性应激刺激引起肾上腺皮质过度分泌糖皮质激素，继而损伤海马神经元。本实验也观察到同样现象。由于高水平的糖皮质激素还能抑制齿状回NSC增殖，从而降低了海马结构的自我修复能力[1]，继而导致海马结构出现不可逆损伤。因此，抑郁症的根治应围绕保护海马成熟神经元和齿状回NSC两方面进行。
定志小丸由远志、石菖蒲、茯苓和人参组成，具有祛痰开窍、健脾益智作用，主治心气不定、五脏不足、忧悲不乐等。实验结果表明，该方能够对抗慢性应激对大鼠行为学的影响，具有抗抑郁作用，这可能与其保护海马CA3区神经元和齿状回NSC增殖有关。尽管定志小丸不能抑制皮质醇的过度分泌，但其维持E2水平的作用可能更为重要，因此，该方可能是替代雌激素的一种选择，成为治疗女性抑郁症的备选药物。
参考文献
[1] Maria Sundberg， Suvi Savola， Anni Hienola， et al. Glucocorticoid hormones decrease proliferation of embryonic neural stem cells through ubiquitin-mediated degradation of cyclin D1[J].J Neuro， 26(20)：5402－5410.