【摘要】 目的 研究急性高眼压缺血再灌注模型中银杏叶提取物对视网膜神经节细胞的保护作用。方法 实验用SD大鼠30只分为3组，分别为阴性对照组、阳性对照组、用药组，每组各10只。大鼠右眼为损伤眼，分别行前房穿刺灌注形成110 mmHg的眼压维持60 min，左眼未做损伤，作为正常对照。阴性对照组于损伤后2 h及此后每日腹腔分别灌胃生理盐水5 mL/kg。按这种给药方法，阳性对照组给予1%灯盏细辛5 mL/kg，用药组给予1%银杏叶提取物5 mL/kg，实验持续时间28 d。动物安死术前5 d用3%荧光金双上丘注射，逆行标记视网膜神经节细胞。做视网膜定向铺片，距离视乳头中心上下左右各2 mm拍摄照片。利用彩色颗粒分析软件做节细胞计数，计算各组节细胞的存活率并做统计分析。结果 阴性对照组、阳性对照组、用药组节细胞存活率分别为61.46%、72.73%、76.20%。用药组与阴性对照组的节细胞存活率存在显著性差异(P&<0.05)，用药组与阳性对照组无显著性差异(P&>0.05)，阳性对照组与阴性对照组之间存在显著性差异(P&<0.05)。结论 在急性高眼压缺血再灌注模型中，银杏叶提取物能有效地保护视网膜节细胞，与阳性对照药灯盏细辛比较，保护节细胞的效果两者接近。
【关键词】 高眼压；视网膜神经节细胞；银杏叶提取物
Abstract：Objective To investigate whether the extact of ginko biloba (EGb761) can protect the retinal ganglion cells (RGC) after acute high intraocular pressure induced retinal ischemia-reperfusion injury. Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly pided into three groups. The negative control group， positive control group， treatment group were given normal saline 5 mL/kg， 1% erigeron breviscapus (vant) hand-mazz (EBHM) 5 mL/kg， 1% EGb761 5 mL/kg， respectively 2 hour after injury and every day after operation. Retinal ganglion cells were retrograde labeled by injection of 3% fluorogold (FG) into both side of superior colliculus 5 days before the death of the rats. Results The average survival rate of retinal ganglion cells were 61.46%， 72.73% and 76.20% in negative control group， positive control group and treatment group respectively. Conclusion EGb761 has neuroprotective effect on retinal ganglion cells in acute high intraocular pressure induced retinal ischemia-reperfusion injury.
Key words：high intraocular pressure；retinal ganglion cells；EGb761
银杏叶提取物在欧美国家用于神经变性疾病的治疗取得良好疗效，笔者利用大鼠急性高眼压诱导缺血再灌注模型，观察银杏叶提取物对视网膜节细胞是否具有保护作用。
1 实验材料
1.1 实验动物及分组
Sprague-Dawley大鼠30只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，雄性，重量200～240 g，眼部检查无异常。随机分为3组(用药组、阳性对照组、阴性对照组)，各10只。所有大鼠右眼做急性高眼压缺血再灌注模型，左眼未处理。
1.2 试药
EGb761浸膏(上海信谊百路达药业有限公司)，灯盏细辛浸膏(湖南湘雅制药有限公司)，氯胺酮注射液、地西泮注射液、荧光金(荧光金公司，美国)。
2 实验方法
2.1 缺血再灌注模型
腹腔注射盐酸氯胺酮3 mL/kg麻醉动物，瞳孔散开后，在手术显微镜下，将连接生理盐水瓶输液管的7号小儿头皮针刺入大鼠前房，避免损伤虹膜及晶体，盐水瓶升高至距离实验眼150 cm处，此高度可在眼内形成110 mmHg的眼压，此时肉眼可见球结膜苍白，眼底镜可见视网膜缺血，维持60 min。而后降低盐水瓶高度使其与实验动物眼部达到同一水平，拨出针头，此时可见眼结膜充血，亦可见视网膜血液，立即重新再灌注，视网膜动脉及静脉立即恢复高眼压前的充盈状态。术后大鼠双眼涂抗生素眼膏，待清醒后回笼，持续喂养28 d。
2.2 给药
阴性对照组于损伤2 h后每日腹腔灌胃生理盐水5 mL/kg。按这种给药方法，阳性对照组给予1%灯盏细辛5 mL/kg，用药组予1%银杏叶提取物5 mL/kg，实验持续时间为28 d。
2.3 逆行标记
动物安死术前5 d采用双上丘注射法逆行标记(RGC)。将动物麻醉，将其固定在脑立体定位仪上，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器吸取3%荧光金，每侧上丘注射2点(前囟后5.9 mm和 6.4 mm，旁开1.4 mm，深4.0 mm)，每点注射1.5 μL。
2.4 视网膜定向铺片[1]
实验第28天，实验动物在深麻醉下，于12点做球结膜缝线标记，立即摘除眼球放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定，2 h后分离视网膜并将其定向铺片，自然干燥。Vectashield H-100荧光增强剂及市售无色指甲油封片。
2.5 图像分析
荧光显微镜拍摄照片，距离视乳头中心2 mm上下左右各拍摄照片一张，照片放大倍数125×。使用联想Mustek扫描仪将照片以100 dpi扫入计算机，使用颗粒分析软件进行RGC计数[2]，将上下左右4张照片RGC数量累加，并转化成该眼RGC单位面积数量。RGC存活率=右眼RGC单位面积数量/左眼RGC单位面积数量×100%。
2.6 统计学方法
使用SPSS for Windows 10.0统计软件包进行数据分析，2组数据的比较采用t检验。
3 结果
实验中由于麻醉及操作意外导致部分大鼠死亡，部分大鼠因节细胞标记不良而使标本不能使用，各实验组实际可使用的大鼠数量分别为8、7、8只。阴性对照组节细胞存活率为58.39%～65.85%，平均61.46%±2.81%；阳性对照组节细胞存活率为65.35%～83.48%，平均72.73%±6.47%；用药组节细胞存活率为67.75%～89.39%，平均76.20%±7.03%。阳性对照组及用药组都与阴性对照组之间存在显著性差异(P=0.02，P=0.04)，阳性对照组与用药组之间无显著性差异(P=0.92)，说明阳性对照药物灯盏细辛与银杏叶提取物都能有效地保护大鼠急性高眼压缺血再灌注模型的视网膜神经节细胞(见图1)。
4 讨论
从目前的研究看，银杏叶提取物众多成分中起主要作用的有两类，银杏黄酮和内酯成分，分别发挥抗氧化和扩张血管的作用[3-5]。此外，它能够抑制谷氨酸导致的N-甲基-D-天冬氨酸受体毒性兴奋，抑制PAF受体兴奋导致的细胞损伤，抑制淀粉样物质的前体(APP)向淀粉样物质转化，这些都从分子生物学水平上阐述了银杏叶提取物作为视神经保护剂的可行性。德国Moreau等[6]用放射性同位素标记后，给动物口服银杏叶提取物，发现在视网膜上有足够的该药物及其代谢产物，说明银杏叶提取物能够通过血眼屏障达到视网膜节细胞而发挥保护作用。目前，该药尚未进行多中心临床研究，但已有用于正常眼压青光眼的报道，以视野为指标，发现它们有良好的作用。
总之，通过该实验证实银杏叶提取物与灯盏细辛一样具有保护视网膜节细胞的作用，其不良反应小，使用安全。它的作用很可能是多侧面、多靶点的，故今后对其作用机制的探讨应从多个方面着手，并对其临床疗效进行观察。
参考文献
[1] 马 科，徐 亮.视网膜定向铺片方法[J].眼科，2002，(4)：238－239.
[2] 马 科，徐 亮，吴立秋，等.使用彩色颗粒分析软件定量视网膜神经节细胞[J].眼科，2002，(6)：364－365.
[3] Tendi EA， Bosetti F， Dasgupta SF， et al. Ginkgo biloba extracts EGb761 and bilobalide increase NADH dehydrogenase mRNA level and mitochondrial respiratory control ratio in PC12 cells[J]. Neurochem Res，2002，27：319－323.
[4] Fital G， Wassilew G. The influence of hypoxia on the myocardium of experimentally diabetic arts with and without protection by Ginkgo biloba extract.Ⅲ.Ultrastructural investigations mitochondria[J].Exp Toxicol Pathol，2001，52：557－568.
[5] Janssens D， Delaive E， Ramacle J，et al.Protection by bilobalide of the ischaemia-induced alterations of the mitochondrial respiratory activity[J].Fundam Clin Pharmacol，2000，14：193－201.
[6] Moreau JP， Eck J， McCabe J， et al. Absorption distribution et elimination de lextrait marque de Ginkgo biloba chez le rat[J]. Presse Med，1996，15：1458－1463.