作者：安红梅，胡兵，史云峰，许丽雯，史秀峰，陈方敏，顾耘，潘露茜，王志
【摘要】 目的 观察补肾阴中药复方对胚胎干细胞活动的影响。方法 选用胚胎干细胞模型CRL-1825细胞株，加入补肾阴中药复方大鼠含药血清，观察补肾阴中药对干细胞分化、凋亡、细胞周期及其关键基因表达的影响。结果 补肾阴中药复方含药血清可以抑制干细胞的分化和凋亡，促进干细胞增殖以及细胞周期的进程，促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达，下调P16INK4a基因的表达。结论 补肾阴中药复方可以促进干细胞增殖、维持其不分化状态。
【关键词】 补肾阴；中药；胚胎干细胞
Abstract： Objective To study the effects of tonifying kidney-yin on activities of embryo stem cell. Methods Embryonic stem cell line CRL-1825 was choosed as model cell in present study， and tonifying kidney-yin herb serum was added to CRL-1825 cell. The influence of tonifying kidney-yin on stem cell differentiation， cell cycle， apotosis and express of key genes were observed. Results Tonifying kidney-yin can inhibit stem cell differentiation and apotosis， promote stem cell proliferation and progression of cell cycle. In addition， tonifying kidney-yin can up-regulate Wnt， Oct4 gene expression， and down-regulation P16INK4a expression. Conclusions Tonifying kidney-yin can promote stem cell proliferation and maintain the state of stem cell.
Key words： Tonifying the kidney-yin；Chiese herb；embryo stem cell
肾在中医学中具有极为重要的地位，肾为先天之本，肾主藏精，其精气促进人体的生长、发育和生殖，是人体生命活动的原动力。笔者从中医肾的角度理解胚胎干细胞，观察了补肾阴对胚胎干细胞增殖、分化、凋亡等基本生命活动的影响，以及补肾阴对胚胎干细胞功能关键决定基因Wnt 、Oct4、P16INK4a基因表达的影响。
1 实验材料
1.1 细胞株与试剂
小鼠胚胎干细胞CRL-1825细胞购自ATCC (American Type Culture Collection)；ATRA(all trans-retinoic acid)购自Panomics公司；DMSO购自Sigma公司；α-MEM培养基购自Hyclone公司；DeadEndTM Fluorometric TUNEL System购自Promega公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂购自Dojindo公司。其余为国产试剂。
1.2 仪器
培养箱：NUAIKE；流式细胞仪：BD FACSCalibur；倒置显微镜、免疫荧光显微镜：Olympus ；酶标仪：Bio-Rad；PCR仪：MJ Research Inc；凝胶成像系统：复日科技。
2 实验方法
2.1 左归丸处方组成及药物制备
熟地黄24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，川牛膝9 g，菟丝子12 g，鹿角胶12 g，龟板胶12 g(按《景岳全书·新方八阵·补阵》中的配伍比例确定剂量)。以补肾中药气味并重的要求，上述药物除鹿角胶、龟板胶外，余药加8倍量水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，过滤，合并滤液。鹿角胶、龟板胶用适量水加热溶化，加入滤液，混匀，滤液浓缩至相对密度1.20(80 ℃)，4 ℃保存备用。由龙华医院中药制剂室提供。
2.2 含药血清的制备
选健康Wistar大鼠32只，雄性，SPF级，体重180～200 g，来源上海中医药大学实验动物中心。大鼠分为左归丸组(小、中、大剂量组)、生理盐水组，每组8只，分别按人鼠药物换算等效剂量的1、2、4倍喂饲大鼠左归丸，生理盐水组灌服等体积生理盐水，每天2次，连续3 d(灌药前禁食不禁水12 h)。末次给药后1 h腹主动脉采血，5 000 r/min离心分离并收集含药血清，56 ℃常规灭活30 min，0.2 μm滤膜过滤除菌，密封后于-20 ℃冰箱保存备用。
2.3 细胞培养与分化观察
CRL-1825细胞常规培养，1～2 d换培养基1次，2～3 d传代一次，传代时常规倒置显微镜观察并记录培养细胞形态。细胞分化实验中加入10%补肾阴中药复方大鼠含药血清(左归丸大、中、小剂量组)以及等体积空白血清(生理盐水组)，作用3 d后每组加入1% DMSO或1 nmol/L ATRA作用14 h，各组细胞进行光镜拍照。根据分化实验及预实验结果确定实验采用10%补肾阴中药复方大鼠含药血清中剂量组。
2.4 细胞增殖检测
细胞增殖采用CCK8方法进行。常规消化细胞，以2×103的密度接种细胞于96孔板，每组设3个复孔；接种后第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，并自接种后第2天开始每天取9孔加入CCK8试剂10 μL，37 ℃反应2 h后，450 nm波长测上清光密度。
2.5 细胞凋亡观测
常规消化细胞，以1×105/盘的密度接种细胞于3.5 cm培养皿，第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，作用3 d后加入400 μmol(终浓度)h3O2，作用14 h后取细胞检测凋亡。细胞凋亡采用TUNEL(TdT-meidated dUTP Nick-End Labling)法检测，操作按Promega公司说明书进行。
2.6 细胞周期的观测
常规消化传代细胞，加入10%含药血清以及等体积空白对照血清作用，3 d后细胞消化离心，调整浓度1×106/mL以上，70%酒精(终浓度)固定，PI(碘化吡啶)染色用于流式细胞仪检测细胞周期变化及增殖特性。
2.7 基因表达
采用RT-PCR法检测基因表达，总RNA在逆转录酶的作用下逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，PCR产物在1%的agarose胶中电泳。反应中所用引物为，Oct3/4：5’- ATTCAGCCAAACGACCAT-3’，5’-CCCTGAGAAAGGAGACCC-3’；P16INK4a：5’-CCCTTGCCTGGAAAGATA-3’，5’-AACTATTCGGTGCGTTGG-3’；Wnt：5’-TGGCTGGGTTTCTGCTAC-3’，5’-CTCGGTTGACGATCTTGC-3’。
3 结果
3.1 补肾阴对胚胎干细胞分化的影响(见图1)
结果显示，CRL-1825细胞可在DMSO作用下分化，细胞呈现出菱形或梭形，丧失干细胞特有的形态以及克隆生长特性；在补肾阴中药的联合作用下，细胞部分分化，有部分细胞尚维持干细胞的形态，并有部分细胞仍呈克隆生长，提示补肾阴可以阻滞干细胞的分化。
3.2 补肾阴对胚胎干细胞增殖的影响
(见表1、图2)表1 补肾阴对胚胎干细胞周期的影响(略)注：与空白血清组以及空白组比较，*P&<0.05。
3.3 补肾阴对胚胎干细胞凋亡的影响
本研究采用h3O2诱导细胞凋亡，观察补肾阴对细胞凋亡的影响。结果显示，补肾阴可抑制h3O2诱导的细胞凋亡，与对照组比较差异显著。
3.4 补肾阴对胚胎干细胞基因表达的影响
在CRL-1825细胞培养基中加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，提取细胞总RNA，RT-PCR检测补肾阴对干细胞基因表达的影响。结果显示，补肾阴可以促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达，下调P16INK4a基因的表达(见图3)。
4 讨论
本研究采用的CRL-1825细胞株来源于小鼠畸胎瘤，具有胚胎干细胞的基本特性。实验结果提示，补肾阴可以促进干细胞增殖，促进胚胎干细胞周期的进程，抑制细胞凋亡，同时可以维持胚胎干细胞不分化的状态，从而在实验体系中验证了胚胎干细胞与中医肾为先天之本、肾主藏精理论的联系。
本实验研究结果还显示，补肾阴可以促进干细胞Wnt、Oct4基因的表达，下调P16INK4a基因的表达。Wnt是Wnt/beta- catenin信号通路的重要蛋白，其在Presenilin酶以及frizzled等配体的作用下进而激活beta-catenin，beta- catenin入核与TCF等转录因子协同作用调控靶基因的转录，在维持干细胞状态方面起着重要的作用[1-2]；Oct4位于6p21.31，含360个氨基酸，同样是一个转录因子，其与ATTTGCAT特异序列结合介导靶基因的转录调控，与细胞核移植后的核再程化(nuclear reprogramming)相关，主要表达于胚胎干细胞，可作为胚胎干细胞的表型标志，并在干细胞增殖以及干细胞状态维持方面起着重要的作用[3-5]。P16INK4a是一个抑癌基因，是细胞周期激酶CDK4的抑制剂，通过调节CDK4以及P53的活性而促进细胞周期的进程，在G1期调控点起着重要的作用[6-8]。结果发现，补肾阴能促进胚胎干细胞增殖，促进细胞周期，以及维持干细胞不分化的状态，因此，有理由认为这与补肾阴上调Wnt、Oct4以及下调P16INK4a基因表达相关。
参考文献
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