作者：徐建亚，顾勤，夏卫军，程罗根
【摘要】 目的 研究活血化瘀中药丹参对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6生长、粘附、侵袭、运动、转移能力的影响，并初步探讨其作用机制。方法 采用MTT法测定丹参对B16-BL6细胞增殖能力的影响；采用细胞粘附实验、重组基底膜侵袭实验、趋化性运动能力实验以及小鼠黑色素瘤自发性转移模型，观察丹参对B16-BL6细胞生长、粘附、侵袭、运动及转移能力的影响。结果 丹参水提液对B16-BL6细胞的增殖具有双向调节作用；能显著促进B16-BL6细胞与基底膜成分纤维粘连蛋白粘附，显著抑制B16-BL6细胞侵袭基底膜能力及趋化性运动能力；能显著减小肺转移结节体积，但对结节数目没有明显作用。结论 丹参提取液能够显著减轻小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6的肺转移程度，可能与其能够抑制B16-BL6细胞对基底膜的侵袭能力以及降低B16-BL6的运动能力有关。
【关键词】 丹参；黑色素瘤细胞株B16-BL6
Abstract：Objective To study the effect of Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM)， a kind of Chinese Traditional Medicine which can dissolve stasis by activating blood circulation， on proliferation， invasion， adhesion， migration and metastasis of B16-BL6 metastatic mouse melanoma cells and discuss its functional mechanism. Methods The proliferation， adhesion， invasion and migration capacity of B16-BL6 metastatic cells was evaluated by MTT assay， adhesion assay and reconstituted basement membrane invasion and migration assay in vitro respectively. Mouse spontaneous melanoma model was used to study the effect of RSM on metastasis in vivo. Results The extract of RSM bidirectionally adjusted the multiplication of B16-BL6 cells， promoted prominently the adhesion of B16-BL6 to Laminin， inhibited significantly B16-BL6 invading reconstituted basement membrane and the migration of B16-BL6. In the mouse spontaneous melanoma model， it suppressed significantly the volume of lung metastatic nodes but had little effect on the number of lung metastatic nodes. Conclusion The extract of RSM can alleviate the degree of the metastasis of B16-BL6 metastatic mouse melanoma cells， which may be related with inhibiting the B16-BL6 cells invading the extracellular matrix and reducing the migration of B16-BL6 cells.
Key words：Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM)；B16-BL6 mouse melanoma
侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征，是导致癌症患者临床死亡的主要原因。因此，阻止肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤治疗成败的关键因素。丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎，其味苦、微寒，入心、心包及肝经，具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痈等功效，可用于月经不调、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等[1]。小鼠黑色素瘤细胞B16-BL6具有高转移特性，是研究肿瘤侵袭转移的理想模型。本实验从体内、体外实验全方位研究丹参对B16-BL6细胞侵袭、粘附、运动和转移能力的影响，希望有助于其临床的进一步应用。
1 实验材料
1.1 药物及试剂
中药的制备：将原药材浸泡于药量10倍的水中1 h，然后文火煎煮2 h，滤出上清后再加8倍量水煎煮1 h，合并2次上清液，静置，3 000 r/min离心15 min。上清在水浴上浓缩为1 g/mL的贮存液，置4 ℃保存。实验前，用DMEM培养液(不含血清)稀释成所需浓度，过滤灭菌，用于体外实验；或者用蒸馏水直接稀释为所需浓度进行体内实验。
DMEM液为Gibco公司产品；新生牛血清(FCS)为杭州四季青产品；牛血清白蛋白(BSA)、噻唑蓝(MTT)为AMRESCO公司产品；纤维粘连蛋白(FN)、Matrigel由北京大学医学部细胞研究室提供；层粘连蛋白(LN)为Sigma公司产品；优凯特胶(Eukitt)为Fluka公司产品；Transwell小室为Costar公司产品；无吡咯烷酮的聚碳酸酯膜PVPF(孔径8.0 μm、直径13 mm)为Whatman公司产品。
1.2 细胞培养
小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6由南京师范大学分子与医学实验室李朝军教授赠送，自行传代保存。B16-BL6细胞在37 ℃和5% CO2条件下，培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中。
1.3 动物
C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g，上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2003-0003]。
2 实验方法
2.1 B16-BL6细胞的增殖抑制实验
参照carmichael的MTT法[2]，取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用培养基稀释成5×104/mL，加入96孔板中，每孔100 μL，每个样品点6个复孔。培养24 h后，换液，每孔加入含药培养液100 μL(丹参终浓度为6.67、3.33、1.67、0.83、0.42 mg/mL，临用时用培养液将贮存液稀释配置)，对照孔直接加入100 μL培养液。37 ℃培养48 h后，每孔加入20 μL MTT(2 mg/mL)，再培养4 h，弃上清液，各孔加入100 μL DMSO溶解结晶，于酶标仪(SPECTRA MAX190)上测量570 nm波长处OD值，实验重复2次。按下式计算药物对细胞生长的抑制率(IR)。
IR(%)=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
2.2 B16-BL6细胞粘附实验[3]
将 LN 2 μg铺于96孔板中，室温过夜干燥后，用2% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)20 μL，37 ℃封闭1 h后，用PBS洗3次，每孔加入8×104个预先经药物作用48 h的B16-BL6细胞，37 ℃和5% CO2培养箱中培养1.5 h后，PBS轻轻吹打2次，洗去未粘附的细胞，弃去残余PBS，每孔加入20 μL MTT(2 mg/mL)，于细胞培养箱中继续培养4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO溶液，振荡混匀后，于酶标仪上测定570 nm处OD值，实验重复2次。按下式计算药物对细胞粘附的抑制率(IR)。
IR(%)=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
2.3 B16-BL6细胞侵袭重组基底膜实验[4]
将PVPF滤膜贴于Transwell小室中，滤膜的外表面涂FN
5 μg，内表面涂Matrigel 10 μg，室温过夜干燥，形成一个基质屏障层。用0.25%胰蛋白酶消化预先经药物处理24 h的B16-BL6细胞，以2×106/mL密度重新悬浮于含0.1% BSA的DMEM无血清培养基中，取100 μL上述细胞悬液加入Transwell小室中。将小室置于24孔板中，加入600 μL含0.1% BSA的DMEM无血清培养基，37 ℃孵育4 h，将滤膜在甲醇中固定1 min，苏木精及伊红染色，擦去Matrigel一侧未穿过膜的细胞，用Eulitt胶将滤膜封于载玻片上，400倍光学显微镜下选择滤膜上下左右中5个不同视野，计数每个视野侵袭细胞数，计算平均值，实验重复2次。按下式计算药物对细胞侵袭的抑制率(IR)。
IR(%)=(1－实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%
2.4 B16-BL6细胞趋化性运动实验[5]
除了在PVPF膜内表面不铺Matrigel，其余步骤与侵袭实验相同。按下式计算药物对细胞运动能力的抑制率(IR)。
IR(%)=(1－实验组平均运动细胞数/对照组平均运动细胞数)×100%
2.5 B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型[6]
取对数生长期的B16-BL6细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，离心收集2次，重悬于PBS中，调整细胞浓度为1×107/mL。每只小鼠右后肢爪垫皮下注射瘤液50 μL。次日将动物随机分组，以等体积(0.4 mL)不同浓度口服灌胃给药，对照组给予等体积生理盐水溶液，连续给药35 d，每天1次。接种瘤液后约3周(对照组瘤体≥10 mm3)时，在0.6%戊巴比妥钠麻醉下高位截除小鼠荷瘤侧后肢。对截下的原发灶后肢称重，并按照公式计算抑瘤率。继续给药约2周，处死动物，称体重。解剖取肺、脾、胸腺，称重，并用10%甲醛溶液固定组织。在解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数，比较各组动物肺转移灶数目及大小。
抑瘤率(%)=(1－实验组平均原发灶后肢重/对照组平均原发灶后肢重)×100%
脾指数(%)=(脾重/体重)×100%
2.6 统计学方法
应用SPSS11.0统计软件对肺转移灶数目采用Mann- Whitney U检验法进行统计学分析，其余计量资料采用Independent-samples T Test检验，计数资料采用Chi-square检验(即χ2检验)。
3 结果
(见表1～表5) 表1 丹参对B16-BL6细胞与LN粘附能力的影响(略)表2 丹参对B16-BL6细胞侵袭重组基底膜及运动能力的影响(略)表3 丹参对C57BL/6小鼠免疫器官及B16-BL6小鼠黑色素瘤生长的影响(略)表4 丹参对B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移的影响(略)表5 丹参对B16-BL6细胞增殖的影响(略)
4 讨论
B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6细胞移植于动物局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常组织和血管，进入血循环，到达远处部位发生肿瘤转移。此模型可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵袭的完整转移过程。本实验在体实验表明，与对照组相比，丹参高、低剂量组肺转移率都有所降低。丹参低剂量组小鼠与对照组相比结节明显减小，肺转移程度减轻(P&<0.05)，表明丹参能够在一定程度上抑制黑色素瘤的转移。体外实验表明，丹参水提液对B16-BL6细胞侵袭重组基底膜能力和趋化性运动能力均有显著的抑制作用。由此可见，丹参可能是通过抑制黑色素瘤细胞的侵袭能力和运动能力达到抗肿瘤转移目的。
本实验结果表明，丹参水提液与B16-BL6细胞作用48 h，有促进细胞与基底膜成分LN的粘附作用，特别是在1.67 mg/mL浓度时有显著作用。由此可见，复方和单味中药的作用不一定一致，复方丹参可能在丹参与降香的相互作用下降低了粘附作用。
综上所述，丹参具有抗黑色素瘤转移的效应，这种效应可能是在丹参抑制瘤细胞的侵袭性和运动能力、加强粘附能力的共同作用下，因前两者作用更显著而表现出来。其抑制肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制还有待深入研究。
参考文献
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