【摘要】 目的 探讨蓬甲饮治疗子宫内膜异位症的作用机理。方法 建立子宫内膜异位症大鼠模型，应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白Caspase-3、Survivin在诱发性子宫内膜异位症动物模型的异位、在位内膜中的表达，从免疫的角度研究蓬甲饮、乌丹丸治疗子宫内膜异位症的作用机制。同时，用TUNEL法检测出细胞的凋亡率。结果 与空白组比较，蓬甲饮低、中、高剂量组及乌丹丸组Caspase-3的表达增加(P&<0.05)，与空白组比较，蓬甲饮中、高剂量组及乌丹丸组Survivin的表达减少(P&<0.05)。结论 蓬甲饮和乌丹丸均增加Caspase-3的表达，降低Survivin的表达，促进细胞凋亡。
【关键词】 蓬甲饮；乌丹丸；细胞凋亡；子宫内膜异位症；动物模型
Abstract：Objective To explore the mechanism of Pengjiayin preparation in the treatment of ectopic endometrium in SD rats. Methods To study the mechanism of Wudan Pill and Pengjiayin preparation in the treatment of ectopic endometrium in immunological way. SD rat models of endometriosis were established， and the expression of Survivin and Caspase-3 protein associated with apoptosis was detected in ectopic and eutopic endometrium in rats with the immunohistochemical method， simultaneously apoptotic cells were detected by TUNEL. Results Compared with the control group， the expression of the caspase-3 was increased in the low dosage group， the midium dosage group and the high dosage group of the Pengjiayin preparation， and the increase was also observed with the Wudan Pill group (P&<0.05). While comparing with the control group， the expression of survivin was decreased in the midium dosage group and the high dosage group of the Pengjiayin preparation， and also in the Wudan Pill group (P&<0.05). Conclusion Pengjiayin preparation and Wudan Pill both can increase the expression of the caspase-3 and decreased the expression of the survivin， which promoting the apoptosis of ectopic endometrium.
Key words：Pengjiayin preparation；Wudan pill；cell apoptosis；endometriosis；animal model
本实验建立子宫内膜异位症大鼠模型，应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白Caspase-3、Survivin在诱发性子宫内膜异位症动物模型的异位、在位内膜中的表达，从免疫的角度研究蓬甲饮、乌丹丸治疗子宫内膜异位症的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药物
蓬甲饮(乌丹丸优化方)；蓬莪术10 g、制鳖甲15 g、丹参10 g、赤芍10 g等9味药物组成，饮片购自北京中医药大学东方医院中药房，将头煎1.5 h与二煎1 h的药液混合，高度浓缩，再以CMC溶解，配成每1 mL含有效煎煮生药量2.656 g的浓度(即高剂量的给药浓度)，高压消毒灭菌，置于-4 ℃冰箱中保存待用。乌丹丸(原名异位痛经丸)，北京中医药大学东方医院院内制剂，由丹参、桃仁、三棱、延胡索、莪术、细辛、水蛭、赤芍、牡丹皮、苏木、鳖甲、穿山甲等22味药物组成，水泛成丸，具有活血化瘀、消癥散结、理气止痛之功效，已在临床应用20多年。84 g/瓶，北京中医药大学东方医院制剂室提供，批号：(98)京卫药制字[052]第F-1264号。将药丸磨成细粉，配成每1 mL 含有原药材2.992 g的浓度，高压消毒灭菌，置于-4 ℃冰箱中保存待用。
1.2 动物
体重为(200±10)g未交配的健康雌性SD大鼠42只，购自北京维通利华实验动物中心，随机分为5组，即空白对照组、蓬甲饮高剂量组、蓬甲饮中剂量组、蓬甲饮低剂量组、乌丹丸组。
1.3 主要试剂
羧甲基纤维素钠(CMC)：北京精求化工有限责任公司提供，批号3405005。原位细胞死亡检测试剂盒；PV-6001辣根酶标记羊抗兔多聚体；PV-6002辣根酶标记羊抗小鼠多聚体；兔抗鼠Caspase 3抗体(1∶100稀释)；鼠抗人Survive抗体工作液；DAB显色剂(3-8试剂购于北京中山生物技术有限公司)。
1.4 造模
造模前2 d每天给造模组大鼠肌肉注射2 mg/mL的苯甲酸雌二醇0.1 mL/(kg·d)以诱导大鼠发情，正常对照组大鼠肌注0.9%氯化钠溶液0.1 mL/(kg·d)以相同刺激。腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g以麻醉大鼠。开腹找到子宫，切下左侧子宫角长约1 cm，行端对端吻合术。将剥离的子宫内膜组织1.5 cm×0.5 cm大小的内膜块，缝合在右侧子宫系膜。剩余内膜组织进行组织学检查，以证实植入物为子宫内膜。缝合切口。
1.5 分组及给药
将造模大鼠随机分为5组：空白对照组8只，乌丹丸组9只，蓬甲饮高剂量组9只，中剂量组8只，低剂量组8只。造模组大鼠平均体重无显著差异性。乌丹丸组和蓬甲饮中剂量组大鼠每千克体重给药量相当于成人每千克体重服药量的8倍。乌丹丸组大鼠每日灌服乌丹丸溶液29.92 g/kg(1 mL/100 g)；蓬甲饮高剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮26.56 g/kg(1 mL/100 g)；中剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1 mL/100 g，浓度稀释为高剂量组的1/2；低剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1 mL/100 g，浓度稀释为高剂量组的1/4。空白对照组每日灌服CMC 1 mL/100 g。各组大鼠均每天固定时间给药，给药4周后，大鼠剩余37只，其中空白对照组8只、蓬甲饮高剂量组8只、中剂量组7只、低剂量组7只、乌丹丸组7只。
1.6免疫组化法分析Caspase-3及Survivin蛋白的表达
给药4周后，于末次给药1 h后取材，取在位、异位内膜，多聚甲醛-戊二醛固定，制备石蜡切片标本。将标本置于37 ℃恒温干燥箱中烘烤2 h后进行免疫组化染色。按SP法染色。参照阳性对照、阴性对照，细胞质或/和细胞膜呈现棕黄色颗粒反应者为阳性，无棕黄色颗粒反应者为阴性。每组选5例染色良好的切片，在显微镜放大40倍下观察，每张切片随机选取5个视野，共25个视野摄入计算机。测量每个视野阳性染色区域的表面积密度，最后计算每组的平均值。
1.6 统计学方法
实验数据应用SPSS10.0统计软件进行统计，各组均数间的差异性用t检验判定，有效率的差异性用卡方检验判定。
2 结果
(见表1～表４)表1 各组大鼠在位内膜与异位内膜细胞凋亡率比较(略)注：与空白组比较，*P&<0.05；与乌丹丸组比较，#P&<0.05(下同)。表2 Caspase-3在在位内膜、异位内膜中的表达(略)表3 Survivin在在位内膜、异位内膜中表达(略)注：与同组在位内膜比较，△P&<0.05。表4 异位子宫内膜Caspase-3和Survivin表达情况(略)
3 讨论
细胞凋亡是基因控制的细胞自然死亡。现在普遍认为，细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶Caspase级联反应(Cascade)事件的结果，Caspase-3(又称CPP32， apopain)被证实处于该级联反应的下游。对Caspase-3-/-小鼠的研究发现，在Fas诱导下，与凋亡有关的形态学变化，如染色质凝集、细胞皱缩、线粒体肿胀和凋亡小体的形成，明显缺乏或延迟出现，提示Caspase-3参与细胞凋亡的较晚期阶段[1]， Caspase-9-/-小鼠显型与Caspase-3-/-小鼠特别相似，但症状较重[2]。从线粒体释放的细胞色素C与Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1， Apaf-1)结合形成复合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9剪切并激活Caspase-3，促进细胞凋亡[3-4]。
Caspase-3通过以下机制促进细胞凋亡：①降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，进而激活Caspase-3形成级联反应；②降解细胞外基质蛋白和骨架蛋白；③降解DNA修复相关分子。其一旦被激活，细胞凋亡即不可逆转。它通过降解细胞内相应底物使细胞死亡，其他下游的Caspase成员可能是凋亡事件的真正执行者。
Survivin是一种新的凋亡抑制基因，是一种结构独特的IAP(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)族凋亡蛋白抑制因子，与细胞分裂、增殖有关，在胚胎组织和恶性肿瘤中表达，正常成年分化组织一般不表达或弱表达[5]。目前认为，大多数促凋亡信号所诱发的细胞凋亡是通过效应性蛋白酶，即Caspase实现的。Caspase-3是一个Fas介导细胞死亡的基本死亡因子，线粒体上p21wafl/cipl或IAP与Caspase-3相互作用启动Caspase-3的灭活。Survivin与Bcl-2的抑制细胞的凋亡机制不同，Bcl-2通过干扰细胞色素C自线粒体释放而阻断Caspase蛋白酶连锁反应的激活；而Survivin的抗凋亡功能在于直接阻断两条凋亡途径下游的共同通路，即Caspase-3和Caspase-7的活性，是一种双重阻断[6]。这一功能通过在细胞内与聚合的微管相互作用来实现。
本研究应用免疫组织化学方法检测了大鼠在空白组，蓬甲饮低、中、高剂量组及乌丹丸组在位内膜、异位内膜的Survivin及Caspase的表达情况，结果发现，蓬甲饮低、中、高剂量各组及乌丹丸组异位内膜Caspase-3的表达水平明显高于在位内膜(P&<0.05)；蓬甲饮低、中、高剂量各组及乌丹丸组异位内膜Survivin的表达明显低于在位内膜(P&<0.05)，并且两者的表达水平呈负相关性。本实验说明蓬甲饮可在一定程度上促进细胞凋亡，其机制可能是通过增加Caspase-3和降低Survivin的表达来实现的。
【参考文献】
[1] Honarpour N， Du C， Richardson JA， et al. Adult Apaf-1-deficient mice exhibit male infertility[J].Dev Biol，2000，218(2)：248－258.
[2] Hakem R， Hakem A， Duncan GS， et al. Differential requirement for caspase-9 in apoptotic pathways in vivo[J].Cell，1998，94(3)：339－352.
[3] Cain K， Bratton SB， Langlais C， et al. Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-k Da and inactive approximately 1， 4-MDa apoptosome complexes[J].J Biol Chem，2000， 275(9)：6067－6070.
[4] Scaffidi C， Fulda S， Srinivasan A， et al. Two CD95(APO-1/Fas) signaling in pathways[J].EMBO J，1998，17(6)：1675－1687.
[5] Hopwood D， Levison DA. Atrophy and apoptosis in the cyclical human endometrium[J].J Pathol，1976，119：159.
[6] Conway Em， Pollefeyt S， Steiner Mosonyi M， et al. Deficiency of Survivin transgenic miceexacerbates Fas-induced apoptosis via mitochondrial pathwaly[J].Gastroenterology，2002，123(2)：619－631.
【摘要】 目的 探讨蓬甲饮治疗子宫内膜异位症的作用机理。方法 建立子宫内膜异位症大鼠模型，应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白Caspase-3、Survivin在诱发性子宫内膜异位症动物模型的异位、在位内膜中的表达，从免疫的角度研究蓬甲饮、乌丹丸治疗子宫内膜异位症的作用机制。同时，用TUNEL法检测出细胞的凋亡率。结果 与空白组比较，蓬甲饮低、中、高剂量组及乌丹丸组Caspase-3的表达增加(P&<0.05)，与空白组比较，蓬甲饮中、高剂量组及乌丹丸组Survivin的表达减少(P&<0.05)。结论 蓬甲饮和乌丹丸均增加Caspase-3的表达，降低Survivin的表达，促进细胞凋亡。
【关键词】 蓬甲饮；乌丹丸；细胞凋亡；子宫内膜异位症；动物模型
Mechanism of Pengjiayin Preparation in the Treatment of Ectopic Endometrium in SD Rats
WANG A-li， ZHOU Lu， WANG Tie-feng
1.Genecology Department， Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of TCM， Beijing 100078， China；2. Genecology Department， Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of TCM， Beijing 100078， China
Abstract：Objective To explore the mechanism of Pengjiayin preparation in the treatment of ectopic endometrium in SD rats. Methods To study the mechanism of Wudan Pill and Pengjiayin preparation in the treatment of ectopic endometrium in immunological way. SD rat models of endometriosis were established， and the expression of Survivin and Caspase-3 protein associated with apoptosis was detected in ectopic and eutopic endometrium in rats with the immunohistochemical method， simultaneously apoptotic cells were detected by TUNEL. Results Compared with the control group， the expression of the caspase-3 was increased in the low dosage group， the midium dosage group and the high dosage group of the Pengjiayin preparation， and the increase was also observed with the Wudan Pill group (P&<0.05). While comparing with the control group， the expression of survivin was decreased in the midium dosage group and the high dosage group of the Pengjiayin preparation， and also in the Wudan Pill group (P&<0.05). Conclusion Pengjiayin preparation and Wudan Pill both can increase the expression of the caspase-3 and decreased the expression of the survivin， which promoting the apoptosis of ectopic endometrium.
Key words：Pengjiayin preparation；Wudan pill；cell apoptosis；endometriosis；animal model
本实验建立子宫内膜异位症大鼠模型，应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白Caspase-3、Survivin在诱发性子宫内膜异位症动物模型的异位、在位内膜中的表达，从免疫的角度研究蓬甲饮、乌丹丸治疗子宫内膜异位症的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药物
蓬甲饮(乌丹丸优化方)；蓬莪术10 g、制鳖甲15 g、丹参10 g、赤芍10 g等9味药物组成，饮片购自北京中医药大学东方医院中药房，将头煎1.5 h与二煎1 h的药液混合，高度浓缩，再以CMC溶解，配成每1 mL含有效煎煮生药量2.656 g的浓度(即高剂量的给药浓度)，高压消毒灭菌，置于-4 ℃冰箱中保存待用。乌丹丸(原名异位痛经丸)，北京中医药大学东方医院院内制剂，由丹参、桃仁、三棱、延胡索、莪术、细辛、水蛭、赤芍、牡丹皮、苏木、鳖甲、穿山甲等22味药物组成，水泛成丸，具有活血化瘀、消癥散结、理气止痛之功效，已在临床应用20多年。84 g/瓶，北京中医药大学东方医院制剂室提供，批号：(98)京卫药制字[052]第F-1264号。将药丸磨成细粉，配成每1 mL 含有原药材2.992 g的浓度，高压消毒灭菌，置于-4 ℃冰箱中保存待用。
1.2 动物
体重为(200±10)g未交配的健康雌性SD大鼠42只，购自北京维通利华实验动物中心，随机分为5组，即空白对照组、蓬甲饮高剂量组、蓬甲饮中剂量组、蓬甲饮低剂量组、乌丹丸组。
1.3 主要试剂
羧甲基纤维素钠(CMC)：北京精求化工有限责任公司提供，批号3405005。原位细胞死亡检测试剂盒；PV-6001辣根酶标记羊抗兔多聚体；PV-6002辣根酶标记羊抗小鼠多聚体；兔抗鼠Caspase 3抗体(1∶100稀释)；鼠抗人Survive抗体工作液；DAB显色剂(3-8试剂购于北京中山生物技术有限公司)。
1.4 造模
造模前2 d每天给造模组大鼠肌肉注射2 mg/mL的苯甲酸雌二醇0.1 mL/(kg·d)以诱导大鼠发情，正常对照组大鼠肌注0.9%氯化钠溶液0.1 mL/(kg·d)以相同刺激。腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g以麻醉大鼠。开腹找到子宫，切下左侧子宫角长约1 cm，行端对端吻合术。将剥离的子宫内膜组织1.5 cm×0.5 cm大小的内膜块，缝合在右侧子宫系膜。剩余内膜组织进行组织学检查，以证实植入物为子宫内膜。缝合切口。
1.5 分组及给药
将造模大鼠随机分为5组：空白对照组8只，乌丹丸组9只，蓬甲饮高剂量组9只，中剂量组8只，低剂量组8只。造模组大鼠平均体重无显著差异性。乌丹丸组和蓬甲饮中剂量组大鼠每千克体重给药量相当于成人每千克体重服药量的8倍。乌丹丸组大鼠每日灌服乌丹丸溶液29.92 g/kg(1 mL/100 g)；蓬甲饮高剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮26.56 g/kg(1 mL/100 g)；中剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1 mL/100 g，浓度稀释为高剂量组的1/2；低剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1 mL/100 g，浓度稀释为高剂量组的1/4。空白对照组每日灌服CMC 1 mL/100 g。各组大鼠均每天固定时间给药，给药4周后，大鼠剩余37只，其中空白对照组8只、蓬甲饮高剂量组8只、中剂量组7只、低剂量组7只、乌丹丸组7只。
1.6免疫组化法分析Caspase-3及Survivin蛋白的表达
给药4周后，于末次给药1 h后取材，取在位、异位内膜，多聚甲醛-戊二醛固定，制备石蜡切片标本。将标本置于37 ℃恒温干燥箱中烘烤2 h后进行免疫组化染色。按SP法染色。参照阳性对照、阴性对照，细胞质或/和细胞膜呈现棕黄色颗粒反应者为阳性，无棕黄色颗粒反应者为阴性。每组选5例染色良好的切片，在显微镜放大40倍下观察，每张切片随机选取5个视野，共25个视野摄入计算机。测量每个视野阳性染色区域的表面积密度，最后计算每组的平均值。
1.6 统计学方法
实验数据应用SPSS10.0统计软件进行统计，各组均数间的差异性用t检验判定，有效率的差异性用卡方检验判定。
2 结果
(见表1～表４)表1 各组大鼠在位内膜与异位内膜细胞凋亡率比较(略)注：与空白组比较，*P&<0.05；与乌丹丸组比较，#P&<0.05(下同)。表2 Caspase-3在在位内膜、异位内膜中的表达(略)表3 Survivin在在位内膜、异位内膜中表达(略)注：与同组在位内膜比较，△P&<0.05。表4 异位子宫内膜Caspase-3和Survivin表达情况(略)
3 讨论
细胞凋亡是基因控制的细胞自然死亡。现在普遍认为，细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶Caspase级联反应(Cascade)事件的结果，Caspase-3(又称CPP32， apopain)被证实处于该级联反应的下游。对Caspase-3-/-小鼠的研究发现，在Fas诱导下，与凋亡有关的形态学变化，如染色质凝集、细胞皱缩、线粒体肿胀和凋亡小体的形成，明显缺乏或延迟出现，提示Caspase-3参与细胞凋亡的较晚期阶段[1]， Caspase-9-/-小鼠显型与Caspase-3-/-小鼠特别相似，但症状较重[2]。从线粒体释放的细胞色素C与Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1， Apaf-1)结合形成复合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9剪切并激活Caspase-3，促进细胞凋亡[3-4]。
Caspase-3通过以下机制促进细胞凋亡：①降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，进而激活Caspase-3形成级联反应；②降解细胞外基质蛋白和骨架蛋白；③降解DNA修复相关分子。其一旦被激活，细胞凋亡即不可逆转。它通过降解细胞内相应底物使细胞死亡，其他下游的Caspase成员可能是凋亡事件的真正执行者。
Survivin是一种新的凋亡抑制基因，是一种结构独特的IAP(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)族凋亡蛋白抑制因子，与细胞分裂、增殖有关，在胚胎组织和恶性肿瘤中表达，正常成年分化组织一般不表达或弱表达[5]。目前认为，大多数促凋亡信号所诱发的细胞凋亡是通过效应性蛋白酶，即Caspase实现的。Caspase-3是一个Fas介导细胞死亡的基本死亡因子，线粒体上p21wafl/cipl或IAP与Caspase-3相互作用启动Caspase-3的灭活。Survivin与Bcl-2的抑制细胞的凋亡机制不同，Bcl-2通过干扰细胞色素C自线粒体释放而阻断Caspase蛋白酶连锁反应的激活；而Survivin的抗凋亡功能在于直接阻断两条凋亡途径下游的共同通路，即Caspase-3和Caspase-7的活性，是一种双重阻断[6]。这一功能通过在细胞内与聚合的微管相互作用来实现。
本研究应用免疫组织化学方法检测了大鼠在空白组，蓬甲饮低、中、高剂量组及乌丹丸组在位内膜、异位内膜的Survivin及Caspase的表达情况，结果发现，蓬甲饮低、中、高剂量各组及乌丹丸组异位内膜Caspase-3的表达水平明显高于在位内膜(P&<0.05)；蓬甲饮低、中、高剂量各组及乌丹丸组异位内膜Survivin的表达明显低于在位内膜(P&<0.05)，并且两者的表达水平呈负相关性。本实验说明蓬甲饮可在一定程度上促进细胞凋亡，其机制可能是通过增加Caspase-3和降低Survivin的表达来实现的。
参考文献
[1] Honarpour N， Du C， Richardson JA， et al. Adult Apaf-1-deficient mice exhibit male infertility[J].Dev Biol，2000，218(2)：248－258.
[2] Hakem R， Hakem A， Duncan GS， et al. Differential requirement for caspase-9 in apoptotic pathways in vivo[J].Cell，1998，94(3)：339－352.
[3] Cain K， Bratton SB， Langlais C， et al. Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-k Da and inactive approximately 1， 4-MDa apoptosome complexes[J].J Biol Chem，2000， 275(9)：6067－6070.
[4] Scaffidi C， Fulda S， Srinivasan A， et al. Two CD95(APO-1/Fas) signaling in pathways[J].EMBO J，1998，17(6)：1675－1687.
[5] Hopwood D， Levison DA. Atrophy and apoptosis in the cyclical human endometrium[J].J Pathol，1976，119：159.
[6] Conway Em， Pollefeyt S， Steiner Mosonyi M， et al. Deficiency of Survivin transgenic miceexacerbates Fas-induced apoptosis via mitochondrial pathwaly[J].Gastroenterology，2002，123(2)：619－631.