作者：褚丽芳 张震 李双成 王建华
【摘要】目的 观察孕酮对脑缺血沙土鼠海马钙结合蛋白Calbindin D-28k，即CB免疫反应的影响。方法 以颈总动脉夹闭法制作脑缺血再灌注模型、免疫细胞化学方法显示海马CB免疫反应的变化。结果 脑缺血再灌注后1～7天，背侧海马CA1区CB阳性神经元开始出现并且数量增多；第7天背侧海马CA1区锥体细胞层呈现CB阳性死亡着色致密条带。孕酮处理后背侧海马CA1区CB阳性神经元进一步增加，且有较长的突起伸至腔隙分子层，未见海马CA1区锥体细胞层CB阳性死亡着色致密条带结构。结论 孕酮具有一定的神经保护作用，调控CB 的表达可能为孕酮的作用机制之一。
【关键词】孕酮 脑缺血 钙结合蛋白 沙土亚科
孕酮（progesterone）作为一种能在神经系统合成的神经活性甾体，通过对神经系统结构和功能的影响，发挥其神经营养和保护作用。研究表明，在各类动物模型中孕酮替代治疗可延缓神经细胞凋亡、减小脑梗死体积、减轻实验性脑缺血损伤、促进神经髓鞘的合成，并且能改善实验动物空间辨别和学习记忆等神经认知功能[1，2]。研究发现，孕酮对脑缺血再灌注后海马CA1区锥体细胞具有明显的神经保护作用。钙结合蛋白Calbindin D-28k，即CB可通过结合胞内钙离子、对抗脑缺血引起的钙超载[3]，孕酮处理后海马CB免疫反应变化如何目前知之甚少。本研究以颈动脉夹闭法制作沙土鼠脑缺血模型，观察孕酮对脑缺血沙土鼠海马CB免疫反应的影响，探讨孕酮对脑缺血神经保护作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性沙土鼠75只（首都医科大学实验动物中心选购），鼠龄4-5个月，体质量50-70g。随机分为假手术组、脑缺血再灌组和孕酮处理组3组，每组25只。孕酮处理组参照Jiang等[4]的给药剂量，分别在血流恢复后即刻、6 h、12 h、24 h及48 h给予腹腔注射孕酮(4.0mg/kg)。
1.2 动物模型的制备 脑缺血再灌组和孕酮处理组经乙醚麻醉后，按Zealonga等[5]的方法，行颈正中切口，游离夹闭双侧颈总动脉、阻断血流20min后，去除动脉夹，缝合切口，制成沙土鼠脑缺血再灌注模型。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余同上。
1.3 标本制备 各组动物在预定存活时间2d或7d，经心灌注生理盐水50ml和4℃4%多聚甲醛固定液（pH7.6）400ml后，开颅取脑，于4%多聚甲醛中后固定4 h，30%蔗糖过夜，冠状位冰冻切片厚40μm，间断集片于0.01mol/L，pH7.6 PBS中，行免疫细胞化学反应。用1:2000小鼠抗CB抗体(sigma)于4℃孵育切片48h；1:400生物素化第二抗体室温2h；1:400 HRP结合链霉亲合素室温1h；行DAB呈色。免疫细胞化学对照实验以PBS代替CB抗体进行反应，其结果为阴性。切片脱水、树脂封片。
1.4 细胞计数及免疫细胞化学染色 每只动物随机选择3张切片的背侧海马CA1区、CA3区锥体细胞层及齿状回颗粒细胞层，观察并计数神经元，因数量较少数据并未列出。依据免疫反应强度分为五级，-，未检测出；±，偶见表达；+，表达较弱；++，中等强度表达；+++，强阳性表达。
2 结果
免疫细胞化学染色发现，假手术组沙土鼠齿状回颗粒细胞及突起CB免疫反应呈强阳性，强阳性的CB免疫反应颗粒细胞及突起之间彼此界限不清表现为一致密带，同时可见自海马齿状回至海马CA3区汇集的CB阳性苔藓纤维。背侧海马CA1 区、CA3区锥体细胞层为CB阴性，在CA1区起层、放射层及腔隙分子层可见散在的CB阳性神经元，在齿状回门区偶见散在的阳性锥体细胞（图1，表1）。腹侧海马CA1区锥体细胞层浅层可见大量CB阳性锥体细胞，其较长的顶树突经放射层伸向腔隙分子层并与该层的CB阳性中间神经元及树突交织成网状。
脑缺血各时程组背侧海马CA1 区、CA3区起层、放射层的CB阳性非锥体神经元未见改变。脑缺血第2d，背侧海马CA1 区锥体细胞层隐约可见CB阳性细胞、并较具细胞形态（图2）；第7d，该区锥体细胞层细胞明显固缩、表现为深染致密的棕黄色条带-点状影像、无细胞轮廓-死亡着色（图3，表1）。但脑缺血第7d，腹侧海马CA1区没有死亡着色现象，仍可见大量的CB阳性锥体细胞及其突起。
孕酮实验组与假手术组及脑缺血组相比，最大不同之处即表现在背侧海马CA1区上，其他部位未见明显区别。本组第2d，可见背侧海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞表达CB，其阳性细胞呈弱至中等反应强度、具有较长的突起伸至腔隙分子层，细胞形态清楚（图4，表1）。第7d，背侧海马CA1 区锥体细胞层未见脑缺血组细胞固缩的棕黄色点状颗粒影像，背侧海马CA1 区锥体细胞层可见大量的CB弱阳性的细胞，具有较明显的细胞形态，较长的阳性顶树突像第2d样伸至腔隙分子层（图5，表1）。
3 讨论
本研究发现沙土鼠脑缺血再灌注后，背侧海马CA1 区CB阳性神经元出现并且数量增多，与Yenari 等[6]研究结果相符。海马CB阳性神经元数量增加可能与脑缺血后钙离子内流、CB与之结合提高检出率有关[7]；也可能与脑缺血后兴奋性氨基酸大量释放，引起胞外钙离子内流[8]、诱发神经元合成更多的CB以增强缓冲胞内钙离子的能力有关。脑缺血再灌海马CA1区出现迟发性细胞死亡后，仍可见许多CB阳性神经元，我们在脑缺血再灌7d所观察到的海马CA1区CB阳性致密条带（密集点状死亡着色）可能是锥体细胞迟发性死亡后、分布于锥体细胞层的CB阳性纤维末梢固缩浓聚而致[9]。本研究发现，孕酮可提高脑缺血再灌后海马CB阳性神经元数量、增加CB阳性纤维突起 (特别是第7d)，这可能与孕酮的神经保护作用有关。
沙土鼠脑缺血再灌后， 孕酮对海马CA1 区锥体细胞具有明显的神经保护作用[9-11]。在Cervantes 等[12]的实验中，发现孕酮不仅可以减少尾状核神经元的丢失，而且可增强黑质GABA 能神经元的兴奋性抑制作用。孕酮对脑缺血的神经保护作用除可能通过清除自由基、加强GABA和(或)抑制兴奋性氨基酸及其受体的活性[10，12]、减少诱生型一氧化氮合酶的表达，从而对非CB神经元发挥保护作用外[13]，还可能通过孕酮受体调控CB神经元蛋白的表达、发挥神经保护作用。我们观察到的CB在脑缺血孕酮组的免疫反应变化很可能是神经元CB表达增加的结果。已知分布于脑内的孕酮受体有雌激素诱导型和非雌激素诱导型，孕酮可能通过非雌激素诱导型孕酮受体，促进了脑缺血再灌后CB的表达，从而增强对胞内钙离子的缓冲能力、对脑缺血受损神经元起到保护作用，对此尚待进一步的研究证实。
参 考 文 献
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图版说明
图 1 假手术组海马CB免疫细胞化学染色，A×40; B×200.
图 2 缺血再灌后 2d 海马CB免疫细胞化学染色，A×40; B×200.
图 3 缺血再灌后 7d 海马CB免疫细胞化学染色，A×40; B×200.
图 4 缺血再灌孕酮处理 2d 后海马CB免疫细胞化学染色，A×40; B×200.
图 5 缺血再灌孕酮处理 7d 后海马CB免疫细胞化学染色，A×40; B×200.
Fig1 CB immunoreactivity in hippocampus of sham-operated， A×40; B×200.
Fig2 CB immunoreactivity in hippocampus after cerebral ischemic reperfusion 2d， A×40; B×200.
Fig3 CB immunoreactivity in hippocampus after cerebral ischemic reperfusion 7d， A×40; B×200.
Fig4 CB immunoreactivity in hippocampus after progesterone treatment following cerebral ischemic reperfusion 2d， A×40; B×200.
Fig5 CB immunoreactivity in hippocampus after progesterone treatment following cerebral ischemic reperfusion 7d， A×40; B×200.
-，未检测出；+，表达较弱；++，中等强度表达；Death stain，死亡着色
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