关于外周血P53基因SNP检测与宫颈癌早期诊断的关系

论文代写网： 【摘要】目的　分析宫颈癌发生过程中P53基因的突变作用，评估外周血P53基因突变分析作为宫颈癌高危对象筛查指标的实际应用价值。方法　用LDR-PCR技术对100例宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和100例健康人（对照组）的外周血P53基因第5-8外显子进行单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism ， SNP)检测。 结果　CIN组和对照组的外周血P53基因的突变率为38%和0，差异有显著性（P&<0.05）。 结论　P53基因突变在宫颈癌的发生过程中起重要作用，外周血P53基因SNP突变分析可望成为宫颈癌高危对象的早期诊断手段。
【关键词】　宫颈肿瘤　LDR-PCR　SNP　P53基因
　　宫颈癌是常见的妇科肿瘤，严重地威胁着女性的生命健康。大量流行病学研究证实，人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生发展的重要环境因素。然而在感染HPV的妇女中，大多数可自行消退，仅少数妇女发展为持续性感染，并进展为宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），甚至宫颈癌，这说明在宫颈癌的发生过程中，还有其他一些危险因素发挥作用。近年来研究表明，除环境与生活方式等外界因素外，宿主与病毒本身的变异因素很可能与疾病的发生发展有一定的相关性。深入理解HPV和宿主因素在宫颈癌发病机制中的作用及其相互关系，对于早期辨别存在HPV持续感染、宫颈病变可能恶性变的高危妇女具有重要意义。宫颈癌的早期诊断技术在宫颈癌的治疗中就起着重要的作用。宫颈细胞学检查是宫颈癌早期筛查的重要方法，40年代首先采用宫颈涂片细胞学检查诊断宫颈癌，称为巴氏涂片法。由于细胞学检查易受多种因素影响，如：取材刮片部位、取材工具、方法、标本染色过程及涂片诊断技术等，不可避免地会导致假阴性出现。通过各种努力，现在已发展到液基细胞学（TCT、TLT），将采集的标本放入保存液小瓶内送检，由仪器自动对细胞进行漂洗、离心、过滤，除去血液纤维、黏液等杂质后，自动制作出均匀的单层细胞涂片并染色，细胞学检查是宫颈癌的初筛手段，还存不足之处。P53 基因的缺失、突变和灭活在许多肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[1 ，2] 。P53基因突变在肿瘤组织中的普遍存在已经成为国内外学者广泛关注的课题。然而，在CIN患者中采用外周血SNP基因突变研究的报道甚少。我们用LDR-SNP 法对CIN患者进行外周血P53基因突变筛查，拟进一步验证宫颈癌发生过程中P53基因的突变作用，并初步评估外周血P53基因SNP分析作为宫颈癌高危对象筛查指标的实际应用价值。LDR-PCR测序分型技术连接酶检测反应 (ligase detection reaction，LDR)是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。先通过多重PCR (Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片断，然后进行多重LDR (Multiplex LDR)，最后通过测序仪电泳读取检测结果 。
　　1　材料与方法
　　1.1 研究对象　标本来源
　　1.2 基因组DNA提取　应用常规饱和酚- 氯仿法提取基因组DNA。
　　1.3 SNP的选取及引物设计　选取P53基因5，6，7，8四个外显子区应用Primer 5软件设计引物( Sangon公司合成)。P53 的引物序列[5]: 第5外显子P1 : TCT GTT CAC TTG TGC CCT GAC TTT C; P2 :ACC CTG GGC AAC CAG CCC TGT CGT C。第6外显子P1 : CAG GGC TGG TTG CCC AGG GTC CCC A;P2 :ACT GAC AAC CAC CCT TAA CCC CTC C。第7外显子P1 :CTC CTA GGT TGG CTC TGA CTG T;P2 :GAG GCT GGG GCA CAG GCC AGT G。第8外显子P1: TAG GAC CTG ATT TCC TTA CTG CCT C; P2 :AAC TGC ACC CTT GGT TCT CTC CAC C。
　　1.4　PCR反应扩增目的片段　反应总体积25μL: 其中基因组DNA约40ng，10×反应缓冲液（MgCl215mmol/L） 2.5μL， dNTP（2.0 mmol/L）2.0μL， 上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL， Taq酶1U。循环参数: 94℃变性5 min， 94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s， 35个循环， 72℃延伸10 min。所有PCR产物均经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认。
　　1.5　统计学分析 应用在线检测程序检测P53组与对照组，应用χ2检验统计分析P53组和对照组基因型频率及等位基因频率。P&<0.05，差异有统计学意义。
　　2　结果
　　CIN组成员突变率：100例CIN组外周血淋巴细胞基因DNA经LDR-PCR分析，结果显示38例有P53基因突变，突变率为38%。100例健康人（对照组）外周血未发现P53基因突变。经统计学分析（P&<0.05）。在所观察的第5-8外显子中，以第8外显子突变率18%（18/100）为最高，其次为第7外显子14%（14/100）和第5外显子6%（6/100），未发现第6外显子突变。结果如表一
　　表一 实验组和对照组在各个外显子中的突变数
　　 转贴于 　　 3　讨论
　　P53基因是一种重要的肿瘤抑制基因。p53基因位于人类17号染色体短臂（17p 13.1）。全长约16-20kb。由11个外显子和10个内含子组成。编码产物为分子量53kD的核蛋白。p53基因在进化过程中高度保守，外显子2、4、5、7、8分别编码5个在进化上高度保守的结构。野生型p53（WT p53）与调控细胞生长周期、调节细胞代谢、DNA的修复和合成、诱导细胞程序性死亡等有密切关系。野生型P53蛋白通过调节基因的转录和阻抑基因的复制以维持调节基因组的稳定并保护细胞对受损DNA的反应以及抑制细胞的增殖功能。p53正常生理功能的丧失与p53基因突变、p53蛋白与病毒癌蛋白结合、p53蛋白与特殊扩增的细胞基因产物结合有关。基因突变是p53功能失活的最主要方式，包括点突变和等位基因的缺失。绝大部分突变位于高度保守区中，以175、248、273、282位点突变最高［2，3］。在P53基因的改变中，点突变是最常见的基因突变。据报道，近90%的突变位点集中在四个进化上高度保守的第2-5功能区，相应于P53基因的第5-8外显子。检测这些外显子子的突变将有助于评估野生型P53基因的激活态势，并对阐明人类肿瘤的发生机理具有重要意义。
　　Hammaberg[4]等人认为: 组织学上未见癌变的组织出现非整倍体DNA细胞时， 应视其为癌变的早期信号。SNP 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。SNP 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点，能够全面地反映基因组的遗传及变异情况[5] 作为第3代遗传标记， SNP具有数目多、分布广、高密度、遗传稳定、易实现自动化分析的特性。因此， SNP在遗传作图、药物开发、法医鉴定、群体遗传学和疾病遗传学等方面显示出强大的应用前景。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变， 它们之间存在着连锁不平衡， 与疾病有着稳定的相关性[5]。因此， 应用高密度的SNP图谱，用关联分析的方法寻找疾病相关基因是一种可行策略。SNP的数量大、分布广.按照1%的频率估计，在人类基因组中每100～300个核苷酸就有一个SNP.因此，整个人类基因组（3.2×109bp）中至少有1，100万以上的SNPs，在任何已知或未知基因内及其附近都可能找到数量不等的SNP. 目前普遍认为，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用.SNP的检测也有助于改善疾病风险的预测、提供疾病早期改变信息并促进有效治疗策略的制定。目前， SNP分析常用方法包括单链构象多态(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)等， 但这些方法检测的灵敏度有赖于试验者的技能， 不适用于SNP大规模筛查。LDR-PCR是最近发展起来的一种灵敏度高、分析量大、成本较低、效率较高的检测方法。在LDR-PCR中检测SNP的灵敏度和精确度可以达到99%以上。
　　p53是最早被研究的与宫颈癌遗传背景相关的抑癌基因。p53基因72位密码子的多态性(C/G)导致所编码氨基酸的不同，p53-Arg比p53-Pro更易于被HPV的癌蛋白E6降解。来自不同地区的研究均认为p53基因72位密码子的多态性与宫颈癌的易感性有关[6，7]，然而，在其他的种族人群中（如欧美和亚非拉地区），p53基因多态性与HPV相关的宫颈癌发病风险之间的关系尚未得到肯定。近来，代谢解毒基因和其他免疫相关基因也进入SNP位点研究领域。有学者[8]研究认为纯合的谷胱甘肽转移酶GSTM1空白基因型比GSTM1阳性杂合基因型的女性罹患宫颈癌的风险高3.3倍。Au等[9]分别对美国和委内瑞拉女性进行研究，发现GSTM1无效基因型对于美国女性增加宫颈癌的发病风险，而对于委内瑞拉女性则不增加风险，说明同一易患因素对于不同种族和人群可能有不同作用。目前，其他SNP位点与宫颈癌发病的关系亦在进一步探索和研究中。
　　p53基因贯穿着宫颈癌的发生、发展、治疗及预后等各个环节。但目前对p53的结构和生物化学功能还没有充分了解。如p53基因与DNA复制的关系，p53基因的反式激活作用以及对特异DNA顺序的结合等。甚至p53基因的微小突变对其结构和功能均产生根本影响，这些都是需要进一步研究的课题。可以肯定，对肿瘤抑制基因p53的研究，将会极大丰富对细胞生长调控和肿瘤病因的认识。对于肿瘤的早发现、早诊断及科学指导临床治疗等各方面都有着很重要的作用。本研究是从分子水平分析基因突变与肿瘤发生之间的关系，通过对外周血P53基因的分析，找出特殊突变位点以作为筛查肿瘤的生物学标记，对宫颈癌的早期发现，诊断有巨大的帮助。
参 考 文 献
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