-80℃冰冻保存血小板参数变化浅析

作者：邓为彬 吴鸣 黄莺 陆燕

【摘要】目的　明确血小板冰冻保存前后血小板参数的变化，并为临床急需应用冰冻血小板的治疗及抢救提供理论依据和实验数据。方法　采集健康人新鲜血进行离心，制作富含血小板的血浆（PRP），采用全自动血细胞分析仪检测并比较冰冻保存前后血小板数量PLT、PCT，MPV，P-LCR ，PDW，PH试纸测PH值；将分离的血小板分别加入保护剂二甲基亚砜（5%DMSO）后迅速置于-80℃低温冰箱保存。1月后对血小板进行复苏，再次检测Plt、MPV、PDW、PCT、P-LCR、PH值。然后对冰冻前后指标进行配对资料t检验。结果　Plt、MPV、PDW、PCT、P-LCR、PH值冰冻前后对比均无统计学意义(P&>0.05)。结论　血小板在-80℃条件下冰冻保存1月，血小板相关参数保持稳定。
【关键词】　冰冻保存　二甲基亚砜　血小板参数
　　随着输血医学的不断发展，临床输用血小板需求量日趋增加。我国临床用血小板快速增长和无偿献血制度的实施，血小板的供需矛盾日趋突出，迫切地需要延长血小板的保存期限。为此，我们用国际普遍使用的生物冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)对人工分离浓缩血小板进行深低温(-80℃)保存，并对解冻后的血小板进行了血小板参数的检测，以期为进一步冰冻血小板的研究提供理论依据和实验数据，也为下一步改进血小板批量冰冻保存技术、提高冰冻血小板质量打下基础。此技术条件可用于长期储备血小板资源，有希望广泛应用于临床。
　　1　材料与方法
　　1.1血小板来源
　　采集12名健康志愿者外周血，年龄21-26岁，男女各6人，符合我国献血体检标准，在献血前1d内没有饮含酒精类饮料，2周内未服用过阿司匹林及其它抗血小板及抗凝血的任何相关药物，未检测到出凝血性疾病，血细胞比容≥0.36，外周血Plt&>150×109/L;将所采集的10ml/人(份)全血共12份，抗凝剂枸橼酸钠(ACD）与全血比为1∶9，置于室温(20℃左右)进行样本处理。将上述的采血离心管在天平上调至平衡（每次离心均需要配平）两侧对称放入离心机中，经反复试验比较， 最佳离心条件为离心力400g能提高血小板数量。即500转／min离心时间为11分钟轻轻取上层黄色清亮液体即制备出新鲜富含血小板血浆(FPRP)。
　　1.2 血小板保存方法
　　取一半新鲜的PRP进行血小板参数测定，剩下的一半在洁净的环境中采用严格的无菌技术缓慢加入生物冷冻保护剂DMSO到冰冻管里至终浓度为(5.0±0.5)%。然后用湿棉布包冰冻管置-80℃冰箱保存，每冰冻管产品留样量4～5mL冻存，冰冻管应拧紧管盖密封保存。1个月后，取出冰冻制品在恒温水浴箱里（温度37-40℃）快速解冻，轻轻摇动至融化，应避免在常温下放置过久。
　　1.3 主要实验试剂及仪器
　　（1）-80℃冰箱（Forma，美国):(2)XE-2100型自动血液检测仪(日本)(3)干燥PH试纸（购于昆明丰科公司):(4)二甲基亚砜（购于天津化学试剂有限公司）
　　1.4 血小板的相关参数的检测
　　分别对冰冻前后的PRP进行测试：（1）取0.15mlPRP在涡流混匀器充分混匀后于自动血细胞检测仪测定血小板浓度（Plt）、血小板压积（PCT）、血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)及大血小板比例（P-LCR）。(2)干燥PH试纸对PRP进行PH值测定，结果精确到0.10。
　　1.5 统计学分析
　　各组资料统计分析采用配对资料的t检验，P &<0.05为差异有显著性。所有资料均SPSS11.5统计软件包进行统计分析。
　　2　结果
　　 　　 新鲜血小板和- 80℃冰冻保存1个月血小板PLT、PCT、MPV、PDW、P-LCR及PH值经配对t检验（P＞0.05），差异无显著性（结果见表1）。
　　表1 -80℃冰冻对正常健康人血小板参数的影响（x-±s）
　　
　　我们的研究结果表明，富含血小板血浆经5%DMSO保存1个月后的血小板Plt、MPV、PDW、PCT、P-LCR和pH在-80℃冰箱保存1个月基本稳定，与新鲜血小板的差异无显著性(P&>0.05)；从血小板浓度Plt、MPV、PCT、及PH来看，其冰冻前后有些变化，其值有变大也有变小的但总体变化程度不大，血小板体外回收率(RR)较高，（回收率均值(RR)=冰冻后血小板数÷冰冻前血小板数×100%)。其结果还是令人满意的。我们发现血小板计数（Plt）部分标本冰冻后浓度值升高，一般来说，由于冰冻过程对血小板的破坏，Plt必然下降。然而我们实验中出现升高其原因可能为①实验误差②检测时，标本在涡流均匀器上未充分混匀。
　　3　讨论
　　DMSO对生物细胞的保护作用原理主要在于[1]: 小分子DMSO易透过细胞膜进入细胞内，增加细胞内溶质溶度，抑制细胞内冰晶形成，有利于细胞内外溶液转变为玻璃化状态，从而使细胞内外的分子运动、生化反应和细胞的生物钟接近停止，使血小板的功能和活性长期得以保持，且由于冰晶被抑制，也减少了细胞内外溶质的浓缩对细胞造成的损伤。同时，相对于0.92g/kg体重的安全剂量，终浓度为5%的DMSO经体内稀释对人体是安全的[2] 。血小板形态学的改变直接关系到冻融后血小板的功能，但形态学改变与血小板功能间的关系尚待进一步研究[3]。据报道，冷冻保存一个月的血小板在超微结构上仍然维持了较好的形态，在外形上尽管出现伪足并向球形转变，但尚未发现空泡样血小板以及血小板互相粘附聚集等严重激活损伤的改变，血小板冻融后形态接近正常，基本结构仍清晰可辩[4]。储存颗粒仍然散布于血小板内，尚未完全进入中央区，储存颗粒仍然可以看到完整的包膜，线粒体完整， DMSO及-80℃的深低温保存对血小板的外衣没有造成破坏[5]。本实验证实DMSO作为防冻剂用于-80℃保存血小板，血小板的超微结构虽然有一定程度的改变，但仍然具有相对完整的超微结构和较好的功能。临床实验证明，冰冻保存血小板不但极大地方便了临床，随用随取，并有良好的止血效果，输注后病人血小板均有不同程度的升高。
　　在实际中，-80℃冰箱长期保存血小板的质量可能随时间延长而下降，而且质量下降程度不确定。与临床每天需多次开门取冰冻血小板相比较，我们使用的专用低温冰箱开门次数和开门时间明显减少，因此不定期的频繁开门、定期除霜和冰箱之间的转移带来的冰冻保存血小板实际温度波动造成的影响较小[6，7]。因此，对冰箱温度的监控和管理，避免停电和频繁开启冰箱门，维持稳定的冰箱温度可能成为今后血小板战略储备库的研究重点。当前冰箱温度连续监测和管理软件在全国各地血站和输血科的逐渐推广应用，为我们进一步研究实际应用中每日开关门造成冰箱温度波动对血小板质量的影响创造了有利条件。
参 考 文 献
[1]刘振北.DMSO冷冻保存血小板及其临床应用[J].右江民族医学院学报， 2004.26(4):590-592.
[2]刘作斌，徐亦清，张佐去等.冷冻保护剂二甲基亚砜的毒副作用及应用剂量研究[J].中国人民解放军军医进修学院学报，1990.11(1):31-33.
[3]金汉珍，黄德珉，官希吉.实用新生儿学(第3版)[M].北京:人民卫生出版社， 2003.421-422.
[4]周晓光，肖昕，农绍汉.新生儿机械通气治疗学[M].北京:人民卫生出版社， 2005.
[5]Monte LF， S ilva FLV， MiyoshiMH， et al Bronchopulmonary dysplas ia[ J] . J Ped iatr，2005.
[6]陈兴智.超低温保存血小板的制备与临床应用[J].检验医学与临床，2007.4(2):106-108.
[7]刘景汉，欧阳锡林，庄远等.-80℃长期保存血小板的可行性研究[J].中国输血杂志，2008.21(4):243-245.