高脂饮食对D半乳糖老化小鼠海马神经元FAS、Bcl2和脑源性神经营养因子表达的影响

　　　　 作者：王昊 李莉 刘霞 肖忠新 宋一志 陆涛 魏守刚

【摘要】 目的 通过对海马FAS、Bcl2和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的观察，研究髙脂饮食对D半乳糖老化小鼠海马神经元退性变的影响。方法 ICR小鼠40只，随机分为正常对照组 (H组)、脑老化模型组 (A组)、脑老化模型髙脂饮食组 (B组)、高脂饮食对照组 (F组)，每组10只。A、B组每日皮下注射半乳糖50 mg/kg体重。H、F组每日给动物注射0.2 ml生理盐水。10 w后，于Morris水迷宫实验结束后，小鼠脑行灌注固定，进行脑冰冻切片，用FAS、Bcl2和BDNF抗体进行免疫组化染色。结果 Morris水迷宫实验测试结果显示A组逃避潜伏期显著大于其他各组(P<0.05);撤台后小鼠的记忆性搜台游泳路程结果在各组小鼠间均无显著差异;FAS免疫组化染色结果显示，B组小鼠海马阳性神经元数目与A组比较无显著差异(P>0.05)，H、F组与A、B组比较，差异显著(P<0.05);Bcl2染色结果显示，A组和B组Bcl2阳性神经元数目显著低于H组(P<0.05)，A组和B组之间、H组和F组之间阳性神经元数目无统计学意义;BDNF染色结果显示A、B和F组BDNF阳性神经元数目显著低于H组(P<0.05)，且A组和B组之间也有显著差异，B组的阳性神经元数目显著少于A组(P<0.05)。结论 D半乳糖老化小鼠海马神经元的FAS表达明显升高，Bcl2和BDNF表达明显下降，高脂饮食虽对脑内FAS、Bcl2表达水平无明显影响，但可使脑内BDNF表达下调。

【关键词】 半乳糖;海马;FAS;Bcl2;BDNF

流行病学调查显示，各种不良生活方式包括饮食可以导致认知障碍和加速衰老。饮食与认知障碍之间的关系甚为复杂，饮食的质量可以直接影响神经功能，并可导致2型糖尿病、心血管疾病、高血压、抑郁等多种慢性疾病，而这些慢性疾病又被认为是认知障碍和痴呆的危险因素〔1〕。目前尚不清楚是饮食直接影响大脑认知功能还是饮食介导多种慢性疾病而引起的认知障碍。本研究采用相同的高脂饮食和喂养时间，观察老年痴呆小鼠与正常小鼠在FAS、脑源性神经营养因子(BDNF)、Bcl2等多个指标的表达差异，以探讨高脂饮食与老年痴呆发病的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 3月龄ICR小鼠，雄性，体重(36～48) g，首都医科大学实验动物中心提供，于屏障系统中饲养，实验期为10 w，自由饮食、水，自然光暗周期饲养。

　　1.2 药物、试剂与仪器 免疫组化用抗体均购自北京中山公司。D半乳糖 (Sigma公司，批号063K0044);SP试剂盒 (美国Zymedlaboratories公司，批号：40387668)。德国Leica公司CM 1850型恒冷冰冻切片机;光学显微镜为日本Olympus公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组及给药 3月龄ICR雄性小鼠，按体重随机分为4组，分别为脑老化模型组 (A组)、脑老化模型高脂饮食组 (B组)、正常对照组 (H组)、高脂饮食对照组 (F组)，每组10只。具体各项实验干预措施如下：A组以D半乳糖50 mg·kg-1·d-1颈背部皮下注射1次/d。高脂饮食组以基础鼠料79%、猪油10%、胆固醇1%、蛋黄粉10%制成清洁级高脂饲料，作为所有涉及高脂膳食小鼠的日粮，常规饲喂。H组：使用普通鼠料喂养，不施以运动、限食、高脂饲料或D半乳糖注射等干预。H组及F组小鼠均以生理盐水0.2 ml·只-1·d-1，颈背部皮下注射。

　　1.3.2 Morris水迷宫实验测试 10 w干预结束后，进行Morris水迷宫实验。水迷宫实验共进行7 d，每天测试1次。将小鼠从站台所在象限的对角象限入水点面向池壁放入水中，以2 min为限通过跟踪摄录系统自动记录其逃避潜伏期作为定位学习记忆成绩。开始3 d为学习期，先将小鼠放在站台上熟悉15 s再下水航行，2 min内不能自动找到站台，则人工帮助其登陆站台并停留15 s用以学习记忆。后2 d为巩固期，让小鼠自由航行2 min寻停站台，不再人工帮助其登陆站台。第6天为正式测试，其逃避潜伏期测试数据用于小鼠学习记忆能力的分析，若2 min内不能自动找到站台则记录为逃避潜伏期120 s。实验时，水池外围参照物保持不变。第7天将站台撤除进行测试，摄像记录小鼠在迷宫内不同象限间寻找记忆中的站台位置时的游泳路径，作空间探索能力分析。

　　1.3.3 免疫组织化学染色及定量分析 10 w后，小鼠用10%水合氯醛按4 ml/kg体重腹腔注射，待麻醉后开胸暴露心脏，经左心室插管快速灌注生理盐水，同时剪开右心耳，待肝脏变白后，改灌4%的多聚甲醛固定液，速度先快后慢，视动物僵直为满意;取脑投入30%蔗糖多聚甲醛溶液中后固定24 h以上，待脑组织下沉后，行小鼠矢状面冰冻切片，待海马CA1区出现后，连续切片，每隔3张取1张，厚度35 μm。切片分为3套，分别滴加1∶1 000稀释的兔抗FAS、Bcl2、BDNF血清，3套孵育液均先在37℃，孵育1.5 h，后置4℃冰箱孵育24 h。经ABC试剂盒完成反应，DAB呈色。以上各步骤间均以0.01 mol/L PBS液中漂洗3次，每次5 min。常规明胶贴片、脱水、透明、封片。每组动物取5只鼠脑，每只鼠脑取相同部位的脑切片，共取20张，在10倍物镜下计数海马的阳性神经元数目。

　　1.4 统计学处理 数据资料以x±s表示，应用SPSS11.0软件统计进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 Morris水迷宫实验结果 A组逃避潜伏期显著大于其他各组(P<0.05);撤台后小鼠的记忆性搜台游泳路程结果各组小鼠间均无显著差异，见表1。表1 各组小鼠Morris水迷宫实验结果比较

　　与A组比较：1)P<0.05图1 各组FAS免疫组化结果(DAB，×20)2.2 免疫组织化学结果 如图1所示，FAS、Bcl2和BDNF免疫组化染色的阳性细胞在海马广泛分布，胞浆及突起内有棕黄色阳性反应颗粒，胞核不着色，阳性细胞为梭形或星形。FAS染色：A组小鼠海马内可见到大的、深染阳性神经元，数目多排列整齐，高倍镜下可见其胞体和突起染色十分清晰;B组小鼠海马阳性神经元数目与A组比较，差异不显著(P>0.05)。H组和F组免疫组化染色结果显示，标记细胞染色淡，细胞轮廓不清晰，突起少;H、F组与A组、B组比较，差异显著(P<0.05)，见表2。Bcl2染色：A组和B组Bcl2阳性神经元数目显著低于H组(P<0.05)。A组和B组之间，H和F组之间阳性神经元数目无统计学意义，见表2。BDNF染色：A组、B组和F组BDNF阳性神经元数目显著低于H组(P<0.05)，且B组的阳性神经元数目显著少于A组(P<0.05)，见表2。表2 小鼠海马FAS、Bcl2和BDNF阳性神经元数目

　　3 讨 论

　　膳食对人脑功能的影响越来越受到人们的重视，现在已经普遍认为限食可延缓老化对大鼠肝脏、肾脏以及整个机体蛋白合成的降低，延长多种动物寿命、提高机体免疫功能、降低多种癌症及退行性疾病的发生率等〔2，3〕。但对于髙脂饮食对神经细胞的老化过程的影响，国内外报道不多。

　　FAS系统是目前研究较为深入的一类凋亡相关基因，又称Apo21或CD95，属于肿瘤坏死因子受体家族及神经生长因子受体家族，是位于细胞膜上的受体，属Ⅰ型膜蛋白，由胞外区、穿膜区和胞浆区组成，胞浆区一段氨基酸序列与TNF受体高度同源，称死亡域。FAS细胞外部分可与抗FAS单克隆抗体或FAS 配体特异性结合，经死亡域传导死亡信号从而介导细胞凋亡〔4〕。Bcl2家族是哺乳动物细胞凋亡的重要调控基因，包括Bcl2、BCLx、Bax、Bak和Bad等蛋白，在中枢大部分区域均有表达。在研究AD和帕金森病(PD)中发现，Bcl2在特定脑区表达异常增加，这种表达上调可能是机体对神经退变性病变的一种补偿机制，也是神经细胞为了保持自身功能的一种自稳机制〔5〕。BDNF属于神经营养素家族，该家族还包括神经生长因子 (NGF)、神经营养素3(NT3)、神经营养素4/5 (NT4/5) 和神经营养素6 (NT6)。研究表明，BDNF通过增加抗凋亡蛋白Bcl2的表达保护神经元抵抗凋亡，有助于衰老的防治〔6〕。本研究表明脑老化小鼠脑内凋亡相关蛋白FAS表达水平增加，而抗凋亡蛋白Bcl2表达下降，BDNF表达下调。高脂饮食使脑内BDNF表达下调。可见，高脂饮食可导致凋亡抑制因子的减少，从而间接促进了神经系统的凋亡的发生。

　　研究表明，Dgal可引起小鼠出现脑老化，表现为记忆巩固和再现障碍等现象，其机制可能是氧自由基介导的脂质过氧化效应〔7〕。本研究提示脑老化可降低小鼠学习能力，这一结论与GonzaloRuiz等〔8〕认为的高脂饮食特别是高胆固醇饮食在体内及体外的实验中均显示可增加Aβ蛋白肽的积累，加重对脑组织的损伤的结论相似。另一方面，胆固醇在AD的病理过程中可以通过细胞内和细胞外与淀粉样斑块产生生理性作用，而这一过程被认为是导致AD病理性改变的早期因素之一。研究〔9〕提出Aβ和APP的生理功能就是调控胆固醇的转移及平衡的。如果这样，胆固醇在脑内的代谢抑制可能成为治疗AD的一种靶标。有研究认为高脂饮食达到总饮食量的10%时，可引起学习和工作记忆的障碍〔10〕，高脂饮食的不同类型也可影响与年龄改变相关的DNA的双链裂解、抗氧化能力及血脂等〔11〕，虽然本研究中所喂养的高脂饮食与GonzaloRuiz等所用的成分及含量有所不同，但均得到了相似的结果。因此认为，高脂饮食可影响神经系统功能的退行性变。

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