脑益康对AD大鼠脑组织炎症损伤的保护作用

　　　　 作者：路燕 周爱玲 周静 施海燕

【摘要】 　　目的 探讨脑益康对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习、记忆能力和脑内炎性反应的影响。方法 采用β淀粉样蛋白1～40(Aβ1～40)右侧海马注射制备AD模型大鼠，脑益康灌胃给药28 d后，采用Y型迷宫刺激器检测大鼠学习、记忆能力，免疫组织化学方法检测大鼠海马肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素6（IL6）的表达情况，酶联免疫吸附法(ELISA)检测皮层白细胞介素1β（IL1β）、转化生长因子β1（TGFβ1）的蛋白水平。结果 脑益康能改善模型大鼠学习记忆能力，显著降低AD大鼠脑组织的IL1β、IL6、TNFα的含量(P＜0.01)，增加TGFβ1的表达(P＜0.01)。结论 脑益康对AD模型大鼠学习记忆能力有改善作用，通过降低AD大鼠脑组织的IL1β、IL6、TNFα的含量，增加TGFβ1的表达，有效抑制海马神经元炎性反应。

【关键词】 阿尔茨海默病；脑益康；β淀粉样蛋白；炎性反应

　　【Abstract】 Objective To investigate effects of Naoyikang on improving learning and memory ability and inflammation reaction of Alzheimers′ disease (AD) model rats. Methods AD model rats were established by the injection of Aβ1～40 into the right hippocampus. After intragastrically administrated with different solution for 28 days， learning and memory abilities of rats were tested by Ymaze. The levels of TNFα and IL6 in AD rats′ hippocampus were detected by immunohistochemistry. The levels of IL1β、TGFβ1 in cortex were measured by ELISA. Results Naoyikang could improve the learning and memory abilities of AD rats，descend significantly the concentration of IL1β、IL6 and TNFα (P＜0.01)， and increase the expression of TGFβ1(P＜0.01).Conclusions Naoyikang can improve the learning and memory abilities of AD rats， and effectively control the inflammation reaction by decreasing the content of IL1β， IL6 and TNFα and increasing the expression of TGFβ1.

　　【Key words】 Alzheimer′s disease; Naoyikang; βAmyloid; Inflammation Reaction

　　目前认为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致的炎症反应是阿尔茨海默病(AD)核心病理机制〔1，2〕。AD病因至今仍未明确，有证据显示AD是一种由多原因引起、涉及多种病理机制和出现多种病理表现的“多因异质性疾病”〔3〕。生化合成药物治疗存在疗效不理想、毒副作用大、价格较昂贵等多方面的问题。本研究观察脑益康对AD大鼠学习、记忆能力和脑内炎性反应的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　雄性SD大鼠，SPF级，体重（220±10）g，由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)20020022。标准鼠饲料常规喂养。

　　1.2 试剂与仪器

　　脑益康（南通市中医院制剂室制成颗粒剂，每克颗粒含生药1.98 g）；脑复康（吡拉西坦片，南京白敬宇制药厂生产，批号：20050812）；羧甲基纤维素钠（分析纯，上海化学试剂站分装厂）；Aβ1～40（Sigma公司，编号：A1075）；肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）、兔抗大鼠多抗(武汉博士德生物工程有限公司，编号：BA0131；武汉博士编号：BA0990)；兔免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，编号：SP9001）；大鼠白介素β（IL1β）、转化生长因子β1(TGFβ1) ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，编号：EK0393/0514）。大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；Y型（MGB型）迷宫刺激器（张家港市三兴教学机械厂）；冰冻切片机（LAICA CM1900，德国）；光学显微镜，日本OLYMPUS公司；ELx800全自动酶标仪（美国宝特仪器有限公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 分组、造模与给药

　　用电迷宫刺激器筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠48只，随机分为6组：假手术组、模型组、脑复康对照组、脑益康低、中、高剂量组；其中，脑益康中剂量相当于临床用量；每组8只。将大鼠用10%水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，颅顶区备皮消毒后作2 cm切口，分离骨膜使头骨暴露。记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）的坐标，参照《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧海马CA1区位置，定位坐标：前囟后3 mm，中线右侧2 mm，硬膜下4 mm，在颅骨定位处钻一小孔，缓慢垂直进针至靶点，然后将5 μl生理盐水以0.5 μl/min的速度缓慢注入，留针5 min，再缓慢撤针，无颅内出血后缝合皮肤，此为假手术组，其余组注射等量Aβ1～40(用无菌生理盐水将冻干粉状Aβ1～40稀释成2 μg/μl，37℃下孵育1 w，使其变为聚集态的Aβ1～40)。所有操作均在无菌条件下进行，手术后大鼠分笼饲养。于术后第2天开始灌胃给药，药物均溶于0.5%羧甲基纤维素钠，假手术组给予生理盐水，模型对照组给予溶剂，脑复康对照组给予0.4 g·kg-1·d-1脑复康，脑益康低、中、高剂量组的药物浓度比依次为1∶2∶4(1.73、3.45、6.90 g·kg-1·d-1)，每日1次，给药容量为10 ml/kg，连续28 d。

　　1.3.2 行为学测试

　　大鼠连续灌胃28 d后，采用Y型迷宫检测大鼠的学习、记忆能力。每次测试固定在上午8:00～12:00进行，保持周围环境安静，避免强光刺激。Y迷宫刺激器为三等臂式迷宫，每臂顶端装有刺激信号灯，灯光信号指示安全区(不通电)。将大鼠放入迷宫的任一臂中，适应环境3 min后给予电刺激（60 V，0.5～0.7 mA，持续2 s）。以大鼠被电击后一次性逃至安全区为为正确反应，否则为错误反应。第2次训练以此安全区作为起步区，并使大鼠停留在安全区1 min以巩固记忆。再次给予电刺激，以此类推，按方向（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ）依次改变安全区位置连续循环电击。学习测试：以测试达到连续10次中有9次（9/10）正确反应前所需的电击次数表示学习能力。记忆再现测试：学习测试完成48 h后，再以同样方法测试。电击次数与其学习记忆能力成反比。

　　1.3.3 取材方法和样品制备

　　将大鼠用10％水合氯醛腹腔麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从左心室插灌注针至升主动脉，剪开右心耳。先快速灌注生理盐水150 ml至流出液清亮，再灌注预冷的4%多聚甲醛500 ml（先快后慢于1 h内灌注完）。灌注结束后迅速断头取脑，去除小脑和嗅球，4%多聚甲醛中后固定6～8 h。将全脑依次移入含20%和30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中进行梯度固定，置于4℃冰箱中至组织块沉烧杯底。取实验所需部位于恒冷切片机中在-20℃下冰冻连续切片，片厚30 μm。

　　1.3.4 大鼠海马TNFα和IL6的表达检测

　　按免疫组化试剂盒方法进行TNFα和IL6免疫组织化学染色，DAB呈色。免疫组化阳性细胞的测定方法：每只大鼠取5张切片，光镜下每张切片计数4个视野(×400)的阳性细胞，总和除以4作为该大鼠的阳性细胞的计数。

　　1.3.5 大鼠皮层IL1β、TGFβ1的表达检测

　　快速断头取大鼠新鲜皮层脑组织，加入10倍体积的组织匀浆缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆，4℃、1 600 r/min离心收集上清液备测，按IL1β、TGFβ1的ELISA试剂盒方法进行操作。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据采用Stata10.0统计软件进行处理，进行方差分析和t检验，各组数据均以x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 脑益康对AD模型大鼠学习、记忆能力的影响

　　在学习能力方面，与假手术组相比，除脑益康高剂量组，其余各组大鼠所需的尝试次数均显著增加（P＜0.01，P＜0.05），各治疗组大鼠所需的尝试次数均明显低于模型组（P＜0.01）。在记忆能力方面，模型组大鼠所需的尝试次数比假手术组显著延长（P＜0.01）；与模型组相比，脑益康各剂量组和脑复康组大鼠所需的尝试次数均明显减少（P＜0.01）。见表1。表1 脑益康对各组大鼠学习、记忆能力的影响(略)

　　2.2 脑益康对AD模型大鼠海马TNFα和IL6表达的影响
　　与假手术组相比，模型组、脑益康低、中剂量组可见较多阳性细胞，胞浆呈棕黄色(P＜0.05，P＜0.01)；与模型组相比，各治疗组阳性细胞数显著减少（P＜0.01）。见表2，图1，图2。表2 各组大鼠海马TNFα、IL6的表达(略)

　　2.3 脑益康对AD模型大鼠皮层IL1β、TGFβ1表达的影响

　　IL1β模型组、脑益康低、中剂量组大脑皮层表达水平增加，和假手术组相比有明显差异（P＜0.01）；各治疗组表达水平和模型组相比显著减少（P＜0.01）。见表3。TGFβ1和假手术组相比，模型组、脑益康低、中剂量组大脑皮层表达水平明显减少（P＜0.01）；治疗后，各组TGFβ1表达水平明显增加，与模型组相比差异显著(P＜0.01)，见表3。表3 各组大鼠皮层IL1β、TGFβ1表达水平(略)

　　3 讨 论

　　Aβ沉积导致的炎症反应是AD的重要病理机制。AD发病早期，炎症反应有利于Aβ的清除，对神经有保护作用。参与调控AD炎症反应的主要细胞因子有IL1β、IL6、TNFα、TGFβ1等，它们作为重要的免疫活性物质，在AD的炎症反应中起着重要的调节作用。这些炎性因子主要由小胶质细胞（MG）和星型胶质细胞(AS)产生〔4〕，同时又可以反过来激活MG和AS产生β淀粉样前体蛋白(βAPP)及Aβ〔5〕，形成恶性正反馈环路，导致APP及Aβ量的剧增。尤其是IL1β，IL1除上调MG或AS表达其他细胞因子，如IL6、TNFα外，尚诱导补体、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基(ROS)、前列腺素、一氧化氮(NO)、S100β、βAPP等生成增加，这些分子各自通过作用于胶质细胞或神经元，促进其他炎性分子的产生，这种交互作用促进了慢性炎症反应的形成和炎性产物水平持续升高，对神经生长与神经可塑性、损伤与变性及各种死亡机制产生广泛的影响〔6〕。另外，TGFβ1是一种多效能生长因子〔7〕，一方面 TGFβ1的过量表达可以诱发或促进βAPP的形成；另一方面直接或间接地通过促进AS产生IL6，继而抑制TNFα生成，保护中枢神经系统，在缺血的脑组织中TGFβ1能降低TNFα、IL1的表达，从而拮抗其神经元毒性效应，起到神经细胞保护作用，而且诱导细胞外基质(ECM) 生成，在AD中，患者TGFβ1含量降低，ECM成分减少，影响了细胞的生长、增殖和分化。

　　本研究结果提示，聚集态的Aβ能够激活神经胶质细胞及炎症反应，支持AD的免疫炎症机制学说，另外，脑益康对脑组织神经胶质细胞的活化增生及TNFα、IL6和IL1β的产生有一定抑制作用，能增强AD大鼠皮层TGFβ1的表达，在一定程度上阻断AD大鼠脑内的炎性损伤，具有保护作用。综上所述，脑益康可在一定程度上抑制Aβ诱导的神经胶质细胞活化增生和炎性产物的表达，减轻Aβ周围的神经元损伤，从而改善大鼠学习记忆能力，起到保护作用。

参考文献

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