雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病模型大鼠海马白细胞介素1β mRNA和蛋白表达的影响

　　　　作者：吕诚 胡小令 杨宝林 万斌 聂菁 薛国勇

【摘要】 　　目的 探讨雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠海马白细胞介素1β（IL1β）mRNA和蛋白表达的影响。方法 30只SD雄性大鼠等分成对照组、模型组、用药组。模型组大鼠给予双侧海马各一次性注射凝聚态Aβ140，对照组大鼠海马注射等量生理盐水，用药组大鼠在海马注射凝聚态Aβ140后腹腔注射雷公藤内酯醇，RTPCR和免疫组织化学方法检测各组大鼠海马IL1βmRNA和蛋白的表达。结果 免疫组织化学染色显示，模型组IL1β阳性细胞数和平均光密度明显高于对照组（P＜0.01），用药组IL1β阳性细胞数和平均光密度较模型组明显减少（P<0.05或0.01）。RTPCR结果显示，模型组IL1βmRNA水平明显高于对照组（P＜0.01），用药组IL1βmRNA水平较模型组明显下降（P＜0.01）。结论 雷公藤内酯醇对AD模型大鼠海马IL1β的表达有抑制作用。

【关键词】 雷公藤内酯醇；阿尔茨海默病；白细胞介素1β；海马

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of triptolide(TP) on the expression of interleukin1β mRNA and protein of hippocampus in model rats with Alzheimer′s disease (AD). Methods Thirty male SD rats were equally pided into control，AD model and TPtreated groups. The AD model group was made with bilateral microinjection of aggregated betaamyloid protein(Aβ)140 into hippocampus in rats and the control group rats were injected with normal saline in the same way.The TPtreated group rats were administered TP intraperitoneally after microinjection of aggregated Aβ140 into hippocampus. The expressions of interleukin1β mRNA and protein of hippocampus in each group were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) and immunohistochemical staining. Results The cell number and average optical density of IL1β positive staining in the AD model group were higher than those in the control group（P＜0.01）， the cell number and average optical density of IL1βpositive staining in the TPtreated group were lower than those in the AD model group（P＜0.05 or 0.01）. The expressions of IL1βmRNA in the AD model group was higher than that in the control group（P＜0.01）. The expression of IL1βmRNA in the TPtreated group was lower than that in the AD model group（P＜0.01）.Conclusions TP can inhibit IL1β expression of hippocampus in model rats with AD.

　　【Key words】 Triptolide; Alzheimer′s disease; Interleukin1β; Hippocampus

　　近年来的研究表明免疫和炎症反应是阿尔茨海默病（AD）病理过程中的一个重要环节，源于AD的免疫炎症学说的抗炎治疗也为AD的防治带来了新的希望〔1〕。白细胞介素1（IL1）是炎症反应的关键性细胞因子，与AD发病关系密切〔2〕。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）具有抗炎、免疫抑制作用〔3〕，其对AD模型大鼠IL1的表达是否有影响尚未见报道。本研究拟用免疫组织化学方法和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法观察TP对AD模型大鼠海马IL1β蛋白和mRNA表达的影响，为防治AD提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　TP（纯度为99.8%，批号070929，福建省医学科学研究所)，溶于4%丙二醇溶液中，经200目过滤器滤过除菌后备用。β淀粉样蛋白(Aβ）140（Sigma公司），兔抗IL1β抗体（Santa Cruz公司），免疫组化（SP）试剂盒（Zymed公司），二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（北京中杉金桥公司），Trizol试剂(Invitrogen公司)，cDNA试剂盒(Fermentas公司)，Marker (北京全式金生物技术有限公司)，PCR扩增用引物(上海生物工程有限公司) ，ImagePro Plus v5.1显微图像分析系统（Media Cybernetics公司），江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪（上海川沙花木农机厂），电脑快速恒温冷冻切片机（金华市益迪医疗设备厂），PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）。

　　1.2 Aβ140的孵育

　　用无菌生理盐水将Aβ140稀释成2 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为凝聚态的Aβ140。

　　1.3 动物分组与处理

　　雄性SD大鼠由南昌大学实验动物科学部提供，体重270～325 g。用Morris水迷宫初筛，去除先天痴呆和游泳姿势不良者，随机抽取10只合格大鼠给予双侧海马（定位坐标为前囟后3.0 mm，双侧旁开 2.0 mm，硬脑膜下 2.9 mm）各一次性注射生理盐水5 μl，设为对照组。其余合格大鼠给予双侧海马（注射部位同上）各一次性注射凝聚态Aβ1405 μl复制AD模型〔4〕，在术后1 w进行Morris水迷宫实验，以对照组大鼠逃避潜伏期均值的95%上限值为标准，将超出上限值者确定为痴呆大鼠。选出造模成功者随机分为模型组和用药组，每组10只。用药组每日腹腔注射TP 0.4 mg/kg，共15 d。对照组和模型组腹腔注射等容积的4%丙二醇溶液。每组实验动物5只用于组织化学、免疫组织化学染色，另外5只用于RTPCR检测。

　　1.4 SP染色及图像分析

　　实验动物用戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，经升主动脉插管，冲洗后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）300 ml灌注，取脑置于上述灌注液中后固定3 h，30%蔗糖浸泡至下沉，在海马注射区附近连续冠状冰冻切片，片厚25 μm，分别进行甲苯胺蓝尼氏染色和SP染色。SP法步骤如下：3%过氧化氢，室温10 min；10%正常山羊血清，室温15 min；兔抗IL1β抗体（1∶100），4℃过夜；生物素标记羊抗兔IgG（1∶100），室温30 min；辣根酶标记链霉卵白素工作液（1∶100），室温30 min；DAB显色。对照组用PBS或正常兔血清代替一抗，重复上述步骤。每个动物取3张切片，每张切片在注射区附近随机取互不重叠的3个视野，在显微镜（×200）下采用ImagePro Plus v5.1显微图像分析系统测出IL1β免疫组织化学染色阳性细胞数和平均光密度。

　　1.5 RTPCR检测

　　①组织总RNA提取及逆转录：实验动物断头处死，快速开颅取脑，取大脑海马组织100 mg，Trizol法提取总RNA，按照逆转录试验盒说明逆转录成cDNA。②基因扩增：IL1β上游引物为5′ATAGCAGCTTTCGACAGTGAG3′，下游引物为5′GTGAAGTCAACTATGTCCCGA3′，产物为755 bp；以βactin为内参，其上游引物为5′GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3′，下游引物为5′TGATCTTCATGGTGCTAGGAGCC3′， 产物为857 bp。反应条件：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s；退火60℃（βactin为58℃）30 s，延伸72℃ 40 s，35个循环；总延伸72℃ 10 min。③电泳及凝胶成像分析：RTPCR产物以1.5％琼脂糖电泳，用Image Tool 2.0软件分析结果，目的基因表达强度以Rv=V(目的基因)／V(βactin)的比值表示。

　　1.6 统计学处理

　　数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件包，OneWay ANONA方差分析，并做多组间的两两比较。

　　2 结 果

　　2.1 甲苯胺蓝尼氏染色

　　对照组大鼠齿状回背侧颗粒细胞带结构完整，可见少量核小深染、胞质不着色的神经胶质细胞；模型组大鼠齿状回背侧颗粒细胞带明显受损，局部神经元大量丢失，出现弥漫性神经胶质细胞浸润。见图1。

　　2.2 SP染色 IL1β免疫反应阳性产物为棕黄色，主要在胞质表达。对照组大鼠海马注射点附近IL1β免疫反应阳性细胞数量较少，染色较淡；模型组大鼠海马注射点附近IL1β免疫反应阳性细胞数量较多，染色较深，与对照组比较，模型组IL1β免疫反应阳性细胞数量明显增多（P＜0.01），平均光密度明显增强（P＜0.01）；用药组大鼠海马注射点附近IL1β免疫反应阳性细胞数量较少，染色较淡，与模型组比较，用药组IL1β免疫反应阳性细胞数量明显减少（P＜0.05），平均光密度明显减弱（P＜0.01）。见表1，图2。
表1 各组大鼠海马IL1β免疫反应阳性细胞数和平均光密度(略)

　　2.3 RTPCR检测

　　在紫外灯下可见各组βactin电泳条带亮度一致，但各组IL1β电泳条带亮度有明显差异。对照组大鼠海马组织IL1β mRNA的表达量(0.767±0.022)低；和对照组相比，模型组大鼠海马组织IL1β mRNA的表达量(0.871±0.042)明显增加（P<0.01）；和模型组相比，用药组大鼠海马组织IL1β mRNA的表达量（0.809±0.036）明显减少（P<0.01）。见图3。

　　3 讨 论

　　IL1是一个具有多种免疫调节功能、可以诱发炎性反应以及机体防御反应的细胞因子，以IL1β为主要分泌形式，是体内作用最强的炎症介质之一〔5〕。AD患者和AD转基因模型鼠脑内IL1含量明显升高〔6〕；将IL1β的诱导剂脂多糖注射入海马可损害大鼠学习记忆能力〔7〕；海马内直接注射IL1β可导致大鼠齿状回颗粒细胞凋亡和大量丢失〔8〕；IL1β的释放参与了Aβ介导的大鼠海马CA1区长时程增强（longterm potentiation，LTP）的损害，IL1受体拮抗剂则可缓解Aβ诱导的LTP抑制〔9〕。本研究发现，将凝聚态Aβ140注射入大鼠海马后，出现弥漫性神经胶质细胞浸润，局部神经元大量丢失，IL1β mRNA和蛋白的表达明显升高。IL1发挥作用的可能机制有：①通过刺激β淀粉样前体蛋白（βAPP）基因的启动子上调βAPP的表达，促进老年斑的形成；②通过自分泌效应和旁分泌效应，激活小胶质细胞和星形胶质细胞，启动“细胞因子循环”；③诱导海马神经元乙酰胆碱酯酶(AchE)mRNA的合成并增加其活性，使乙酰胆碱的生成减少；④诱导神经元P38MAPK信号转录因子表达增加，使特异性位点的tau蛋白磷酸化，促进神经纤维缠结形成〔2，6，10〕。

　　AD免疫炎症学说的确立促使人们寻找抗炎药物或免疫调节剂治疗AD的可能。TP又名T10或雷公藤甲素，是从卫矛科植物雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，具有较强的抗炎、免疫抑制作用，且能透过血脑屏障〔3〕。本文的前期工作表明，TP可以抑制AD模型大鼠海马核因子κB（NFκB）的表达，改善其学习记忆能力〔11〕。本实验显示，给予TP治疗后，AD模型大鼠海马IL1β mRNA和蛋白的表达明显下降。由于NFκB调控的靶基因包括细胞因子、黏附分子、趋化因子、急性期蛋白等，因此推测TP可能通过抑制AD模型大鼠NFκB的活化，减少IL1β等炎性介质的释放，减轻神经元的损伤，从而改善动物学习记忆能力。但由于AD免疫炎症病理过程非常复杂，TP对AD模型大鼠作用的详细机制还有待于进一步深入的研究。

参考文献

　　1 McNaull BB，Todd S，McGuinness B，et al.Inflammation and antiinflammatory strategies for Alzheimer′s disease——a minireview〔J〕. Gerontology，2010;56(1):34.

　　2 郭 峰，杨 华，屈秋民.白细胞介素1与阿尔茨海默病〔J〕.中国临床康复，2006;10(18)：1235.

　　3 简晓红，李小红，游平波，等.雷公藤甲素对DSP4致大鼠蓝斑NE能神经元丢失及海马NE能神经纤维溃变的影响〔J〕.神经解剖学杂志，2008;24(4):396400.

　　4 Li LX，Dai JP，Ru LQ，et al.Effects of tanshinone on neuropathological changes induced by amyloid betapeptide(140) injection in rat hippocampus〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2004；25(7):8618.

　　5 崔国红.炎症与阿尔茨海默病和2型糖尿病关系的研究进展〔J〕.国外医学·卫生学分册，2009；36(3):16973.

　　6 Shaftel SS，Griffin WS，O′Banion MK.The role of interleukin1 in neuroinflammation and Alzheimer disease:an evolving perspective〔J〕.J Neuroinflam，2008；5:7.

　　7 Tanaka S，Ide M，Shibutani T，et al.Lipopolysaccharideinduced microglial activation induces learning and memory deficits without neuronal cell death in rats〔J〕.J Neurosci Res，2006；83(4):55766.

　　8 Depino A，Ferrari C，Pott Godoy MC，et al.Differential effects of interleukin1beta on neurotoxicity，cytokine induction and glial reaction in specific brain regions〔J〕.J Neuroimmunol，2005；168(12):96110.

　　9 Schmid AW，Lynch MA，Herron CE.The effects of IL1 receptor antagonist on beta amyloid mediated depression of LTP in the rat CA1 in vivo〔J〕.Hippocampus，2009；19(7):6706.

　　10 Griffin WS，Liu L，Li Y，et al.Interleukin1 mediates Alzheimer and Lewy body pathologies〔J〕.J Neuroinflam，2006；3:5.

　　11 吕 诚，胡小令，万 斌，等.雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力和海马核因子κB表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(17):21868.