刺五加对痴呆模型小鼠记忆障碍及MDA含量、SOD和乙酰胆碱酯酶活性的影

【摘要】 　　目的 观察刺五加提取液对老年性痴呆(AD)模型小鼠学习记忆障碍及脑组织生化学改变的保护作用。方法 50只健康昆明种小鼠雌雄各半，随机分为5组，对照组、AD模型组、刺五加低剂量组、刺五加高剂量组、脑复康组。50 d隔日腹腔注射三氯化铝100 mg/kg小鼠，建立拟AD模型，采用跳台实验和水迷宫测试方法和生化学检测方法，观察刺五加提取液对AD模型小鼠学习记忆障碍的影响以及脑组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、乙酰胆碱酯酶（TChE）活性改变的影响。结果 模型组跳台实验潜伏期缩短、错误反应率增加（P＜0.05）；水迷宫实验中小鼠全程游泳时间延长、无误率减少，脑组织MDA含量增高、SOD活性降低、TChE活性增加（P＜0.05）。同时给予低、高剂量刺五加提取液不同程度地缓解学习记忆能力障碍及脑组织生化学改变（P＜0.05，P＜0.01）。结论 刺五加提取液通过提高小鼠脑组织中SOD活性和抑制脑中TChE活性，明显改善AD模型小鼠的学习记忆障碍及脑组织生化学改变，对AD有一定的改善和保护作用。

【关键词】 刺五加；老年痴呆；MDA；SOD；TChE

　　老年性痴呆（AD）病因及发病机制迄今尚不清楚，更没有研究出根治AD病的药物，目前在临床上已经使用的治疗药物副作用大，疗效均不能令人满意〔1〕。中药刺五加（Acanthopanax senticosus）为五加科植物，味辛、微苦、性温、无毒，具有多种药理作用和临床应用，能益气健脾、补肾安神，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦〔2〕。本文采用慢性铝中毒模型，选用行为学测试方法和脑组织生化学检测方法，初步探讨了刺五加提取液对AD的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　本院实验动物科提供的昆明种小鼠50只，体重18～20 g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。刺五加药材由延边成大药品有限公司提供。取0.5 kg刺五加，先用水浸泡1 h后加1.5 kg的水，每次煮沸1 h，共提取3次，把提取液合并浓缩至500 ml，然后加水配制成25％（250 g/L）和50％(500 g/L)的刺五加溶液。三氯化铝为分析纯，由北京化工厂生产；脑复康片由山东罗欣药业股份有限公司生产；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（TChE）试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测试盒均由南京建成生物工程有限公司购买。

　　1.2 仪器与设备

　　水迷宫实验记录3 min内小鼠到达终点前的错误次数。小鼠跳台仪，移液器，组织匀浆机，722分光光度计，离心机，分析天平等均由本院基础部预防医学实验中心提供。

　　1.3 小鼠模型建立

　　①对照组：按小鼠每10 g体重0.1 ml的标准每日上午灌胃给予0.85％生理盐水，5 d后开始下午隔日腹腔注射等体积的生理盐水；②模型组：每日上午灌胃给予0.85％生理盐水，5 d后开始下午隔日腹腔注射三氯化铝100 mg/kg；③刺五加25％组（刺1组）：每日上午灌胃给予25％刺五加液，5 d后开始下午隔日腹腔注射三氯化铝；④刺五加50％组（刺2组）：每日上午灌胃给予50％刺五加液，5 d后开始下午隔日腹腔注射三氯化铝；⑤脑复康组：每日上午灌胃给予脑复康230 mg/kg，5 d后开始下午隔日注射三氯化铝。各组连续腹腔注射20次，实验时间共为50 d。每天观察动物一般症状，包括行为状态、体征、饮水量、摄食等，每天记录一次体重。

　　1.4 记忆障碍测试

　　跳台实验在小鼠染毒第15天进行训练，过24 h后重新测试，观察其跳台的潜伏期和3 min内跳台的错误次数。在长方形迷宫中注入温水，水温保持在30℃ 左右。测定前2 d训练小鼠，每日4次，共训练8次，让小鼠能沿着正确的路线游动到终点。染毒第20，23，26，29天分别测试其全程游泳时间、错误次数及无误率。

　　1.5 脑组织中MDA含量、SOD、TChE活性检测

　　处死小鼠，立即取全脑，用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取组织重量，加9倍量的匀浆液，用匀浆器匀浆（操作要在冰水浴中进行），制成10%匀浆液，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用考马斯亮蓝显色法测定脑组织蛋白含量。MDA含量测定：MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，测吸光度值。SOD测定：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2），后者氧化胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。 TChE测定：乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生成TNB（对三硝基苯）黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力。

　　1.6 统计学处理

　　计量资料以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件，进行多个样本均数的单因素方差分析和χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 刺五加对AD模型小鼠学习记忆能力的影响

　　跳台实验中，模型组与对照组比较，错误次数明显增多，平均潜伏期明显缩短（P＜0.01），学习记忆能力明显减退。脑复康组和两组刺五加组与模型组比较，错误次数明显减少，潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01），见表1。水迷宫实验中，模型组与对照组相比错误次数明显增多，模型组小鼠到达终点平台潜伏期显著增加，其全程游泳时间延长（P＜0.05），其无误率低于其他各组。脑复康和刺五加提取液组错误次数明显减少，其游泳时间减短（P＜0.05，P＜0.01），无误率也高于模型组，见表2和表3。表1 跳台实验结果(略)表2 水迷宫实验中无误率结果(略)表3 水迷宫实验中游泳时间结果(略)

　　2.2 刺五加提取液对痴呆模型小鼠的大脑MDA水平和SOD、TChE活性的影响

　　模型组小鼠大脑MDA水平与对照组比较显著增高（P＜0.05），SOD活性与对照组比较有明显降低（P＜0.01）。刺五加低、高剂量组不同程度地改善三氯化铝引起的MDA水平增加及SOD活性降低，两项与模型组比较均有显著差异（P＜0.05）。模型组TchE酶活性显著增高，与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。刺五加低、高剂量组能改善这种酶活性改变，与模型组相比均有显著差异（P＜0.05），见表4。表4 刺五加提取液对AD模型小鼠脑组织MDA水平、SOD、TChE活性的影响(略)

　　3 讨 论

　　铝是AD患病的一个重要的危险因素。饮水含铝量高的地区，AD的发病率较高，为其他地区的1.5～2.7倍〔7〕。动物实验表明，铝在中枢神经系统的沉积可明显抑制学习记忆功能，使动物出现AD的特征性病理改变〔3〕。AD模型小鼠在跳台实验和水迷宫实验中学习记忆能力发生明显障碍，表现为错误次数增加和潜伏期明显缩短〔9〕，此次实验采用三氯化铝致AD模型结果小鼠学习记忆能力有明显缺陷，刺五加提取液能改善此种学习记忆能力障碍。

　　到目前为止，AD病因及发病机制尚不清楚，众多研究者从不同角度提出了各种发病假说、胆碱功能低下假说、炎症或免疫假说、基因突变假说、淀粉样蛋白假说、氧化应激假说、凋亡假说等。AD小鼠产生过量的自由基使脑组织脂质过氧化增加，产生过量的MDA，使脑中的MDA水平增加，细胞的合成能力降低，使SOD活性显著下降。SOD是体内重要的抗氧化酶，可以通过歧化作用清除超氧阴离子自由基，从而保护机体的细胞和组织，延缓衰老过程。铝制剂可以使大鼠、小鼠和人的学习记忆能力下降，降低脑组织SOD活性〔6〕，本次实验中AD模型小鼠脑组织中SOD活性降低、MDA含量增加，与文献结果相符〔4，5〕。刺五加提取液对于铝所致的学习记忆障碍有所改善作用，其作用机制可能是：可使脑组织脂褐质含量下降，使SOD活性增高，有效清除了过量的自由基，使脑组织免受伤害，从而提高学习记忆能力。

　　AD产生的另外一个重要机制是“胆碱能损害”学说〔8〕，与AD关系最为密切的神经递质是乙酰胆碱，乙酰胆碱的减少程度与AD的严重性呈正相关。阮迪云〔10〕报道，胆碱类递质参与学习记忆过程，任何影响乙酰胆碱的合成、贮存及释放的因素，均可造成乙酰胆碱水平的下降，从而影响记忆及认识功能，乙酰胆碱合成不足进一步造成脑糖代谢障碍。
　　
　　本实验中测试了乙酰胆碱酯酶，间接探讨了乙酰胆碱水平。结果表明低、高剂量组刺五加都能不同程度地拮抗AD模型小鼠乙酰胆碱酯酶活性的增高。刺五加提取液对自由基系统的调节作用和对胆碱能神经系统的保护作用，可能是改善学习记忆障碍的主要机制。本研究表明，刺五加提取液对AD所致学习记忆障碍有明显的改善作用以及对脑组织生化学改变有一定的保护作用。

参考文献

　　1 肖增平，吉爱国.老年痴呆的发病机制及治疗的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2008；28(1）:957.

　　2 张喜旺，杨亚平.中药刺五加化学成分研究的最新进展〔J〕.时珍国医国药，2002；13（1）：45.

　　3 张忠贤，孙秀发，朱清华.铝与脂质过氧化〔J〕.国外医学·卫生学分册，1999；26（4）：21924.

　　4 刘永琦，何建成，安耀荣，等.扶元补脑冲剂对老年性痴呆ATP酶及脂质过氧化反应的影响〔J〕.中成药，2004；26（2）：1303.

　　5 沈丽霞，李淑娟，张丹参，等.大黄酚对小鼠记忆障碍的作用及其机制分析〔J〕.中国药理学通报，2003；19（8）：9068.

　　6 张万起，徐格晟，黄国伟，等.SOD活性与铝负荷水平关系研究〔J〕.中华老年医学杂志，1994；13（3）：1657.

　　7 吕永贞，张 丽.老年痴呆的临床分析与护理〔J〕.工企医刊，2006；19（2）：55.

　　8 刘 畅，王 哲.阿尔茨海默病发病机制研究进展〔J〕.脑卒中与神经疾病杂志，2003；20（1）：8991.

　　9 罗 兰，王晓雯，刘凤霞，等.肉苁蓉总苷对三氯化铝致小鼠学习记忆障碍的保护作用〔J〕.中国新药与临床杂志，2007；26（1）：336.

　　10 阮迪云.铅影响学习记忆的细胞和分子机制〔J〕.卫生毒理学杂志，1996；10（3）：153.