氯离子通道阻断剂对大鼠离体海马神经元凋亡的影响

　　　　 作者：常全忠 张淑玲 蔡仕宁 尹金宝

【摘要】 　　目的 通过观察氯离子（Cl-）通道阻断剂对一氧化氮（NO）供体3吗啉斯德酮胺（SIN1）诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的效应，探讨Cl-通道在缺血性脑损伤中的作用。方法 离体培养12 d的SD大鼠海马神经元，随机分为正常对照组、SIN1处理组、SIN1处理后和Cl-通道阻断剂组，对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率。结果 SIN1能明显诱导神经元凋亡（P<0.05），SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤，提高神经元的存活率，与SIN1组相比差异显著（P<0.05）。结论 Cl-通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用。

【关键词】 氯离子通道；NO；海马；大鼠；凋亡

　　【Abstract】Objective To observe the effects of two kinds of chloride channel blockers SITS and DIDS on the hippocampal neuronal damage induced by NO in culture and explore the roles of chlorides in the cerebral ischemic injury. Methods The cultures were pided into 3 groups: control， NO treatment， NO treatment plus chloride channel blocker groups. The cultures were detected with the methods of morphological stain (Hoechst 33258) and MTT quantitative analysis to observe the apoptotic neurons and neuronal viabilities. Results There was a significant protective effects of SITS and DIDS on neuronal damage with dosedependence. Conclusions Chloride channel blockers have some protective effects against neuronal injury induced by NO.

　　【Key words】 Chloride channel; NO; Hippocampus; Rat; Apoptosis

　　在缺血性脑神经元死亡的离子机制研究方面，关于钙离子（Ca2+）通道和钾离子（K+）通道参与神经元凋亡的研究报告较多，而对氯离子（Cl-）通道的作用报告不多。在星状孢子素STS诱导小鼠皮层和NMDA诱导大鼠海马神经元损伤模型上，用Cl-通道阻断剂DIDS对神经元的损伤有明显保护作用〔1，2〕。有研究认为，不是Ca2+和K+的活动而是Cl-通道的活动参与了STS诱导的大鼠皮层神经元的损伤〔3〕。本研究模拟缺血性脑损伤的发生机制，利用3-吗啉斯德酮胺(SIN1)作为一氧化氮（NO）供体诱导离体大鼠海马神经元凋亡，观察Cl-通道的活动是否参与神经元的凋亡过程，探讨缺血缺氧敏感性神经元的凋亡与Cl-通道活动之间关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和试剂

　　新生1 d的SD大鼠（遵义医学院动物中心提供）；DMEM/Ham′s F12 培养基（购自Gibco BRL公司），多聚赖氨酸（polyDLysine，PLL）、阿糖胞苷、SIN1、4乙酰氨基4′异氰酸芪2，2′二磺酸（SITS）、二异硫氰基苯2，2′二磺酸（DIDS）、Hoechst33258 等试剂购自美国Sigma公司；胎牛血清（杭州四季青公司）； 抗Caspases3（Santa Cruz ）。

　　1.2 海马神经元的培养

　　参照方法〔4〕取生1 d内的SD大鼠，雌雄不拘，无菌断头取脑，分离双侧海马，用0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min，加基础培养基终止消化，机械吹打分散细胞，500目筛网过滤，1 000 r/min室温离心10 min，去上清液，加完全培养基，吹打分散细胞后制成4×105个/ml的单细胞悬液，接种在预先包被有PLL的24孔或96孔培养扳内，通以95%空气、5% CO2，37℃饱和湿度下培养。培养液中含有90% DMEM/F12、10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/ml青、链霉素。接种48 h后更换培养液，同时加入1×10-5mol/L阿糖胞苷作用48 h，以抑制胶质细胞的过度增殖。以后每周更换培养液2次。

　　1.3 实验分组

　　取培养9 d的海马神经元，随机分为：正常对照组（仅用完全培养基）；SIN1处理组：1.0 mmol/L SINH作用18 h；SIN1处理后加Cl-通道阻断剂组：SITS浓度分别为：0.05、0.3、0.5、1.0、2.0 mmol/L；DIDS浓度分别为10、50、100、200、300 mmol/L。观察Cl-通道阻断剂的效应时与SIN1同时加入培养基内，作用18 h。

　　1.4 形态学观察

　　取培养的各组神经元，用0.01 mol/L pH7.4的PBS冲洗1次，用4%多聚甲醛固定15 min，空气干燥后Hoechst 33258（5 μg/ml）染色15 min，用0.01 mol/L pH7.4的PBS冲洗2次，倒置荧光显微镜观察细胞核的形态。每次随机数3个视野内200个细胞左右，记阳性凋亡细胞（%）。

　　1.5 MTT测定细胞的存活率

　　参照方法〔1〕，取96孔培养板培养12 d的海马神经元，加入MTT，终浓度为0.5 mg/ml，37℃下继续培养4 h，吸去培养液，加入DMSO，以不加细胞的培养液空白孔作对照，酶标仪检测光密度OD570 mm，细胞存活率（%）=（实验组OD空白对照OD）/（对照组OD空白组OD）×100%。

　　1.6 作图和实验统计分析

　　用Origin7.0作图。实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0软件包，行单因素方差分析组间比较。

　　2 结 果

　　2.1 SITS和DIDS拮抗NO作用的浓度效应

　　1 mmol/L SITS和0.1 mmol/L DIDS的保护效应比较明显，从图1可见浓度低于0.3 mmol/L 的SITS 没有明显的保护效应，0.5～2 mmol/L 有明显的保护损伤作用。从图2可见， 10～200 μmol/L DIDS 能提高神经元的存活率，300 μmol/L没有明显的保护作用。

　　2.2 SITS和DIDS对神经元形态学的影响

　　Hoechst33258 染色后，正常神经元的细胞核呈卵圆形，荧光显微镜下呈现均匀的蓝色荧光；凋亡的神经元皱缩或变圆、染色质浓集或断裂或出现凋亡小体，呈强亮的蓝色荧光，Cl-通道阻断剂能明显减少神经元的凋亡(图3、图4)。

　　3 讨 论

　　在缺血性脑损伤中，海马是最容易损伤的部位，而且凋亡是缺血后的半暗区神经元的主要死亡形式，在缺血性脑损伤中NO的过量产生参与了神经元凋亡的过程。本实验模拟缺血性脑损伤的发生机制，用SIN1作为NO供体诱导离体大鼠海马神经元凋亡。SIN1在水溶液中能释放出大量NO并形成OONO自由基产生细胞毒性作用〔5〕。用Hoechest 33258荧光染色显示这种毒性损伤作用主要是凋亡，与文献报道一致〔1〕。

　　为观察Cl-通道的活动是否参与神经元的凋亡发生，本实验分别观察了不同浓度SITS和DIDS对SIN1作用后神经元凋亡数目和细胞存活率的影响，结果显示，二者均能不同程度地保护神经元的损伤，减少凋亡数目，提高细胞生存率，这种保护作用均有明显的浓度依赖性，二者的最佳有效浓度分别是1 mmol/L和 0.2 mmol/L。Cl-通道阻断剂的这种抗凋亡效应与在其他实验凋亡模型上报道的结果一致〔6〕。

　　有研究认为，暴露NMDA 10 min的大鼠海马切片能引起明显的Cl-内流，Cl-的内流可引起细胞水肿，并且Cl-的内流是细胞外液Cl-和Na+依赖性的，而与细胞外液Ca2+是非依赖性的〔7〕。本实验用NO诱导神经元凋亡过程中Cl-通道的活动与其他离子通道的关系如何，其他离子是否参与这种类型的神经元凋亡，我们将进一步研究。

　　本实验结果初步提示，Cl-通道可能参与了NO诱导的神经元凋亡过程。揭示Cl-通道在神经元凋亡中的作用，将为缺血性脑损伤神经元凋亡的发生机制从离子通道方面提供新的理论。

参考文献

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　　2 常全忠，张淑玲.氯通道阻断剂对N甲基D天冬氨酸诱导培养海马神经元凋亡的作用〔J〕.中国临床康复杂志，2006;26(2):15861.

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　　5 Ggao MQ，Guo SB，Chen XH，et al.Molecular mechanisms of polypeptide from chlamas farrier protecting Hacat cells from apoptosis induced by UVA plus UVB〔J〕.Acta Pharmcol Sin，2007;28(7):100714.

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　　7 Inglefield JR，SchwartzBloom RD.Activation of excitatory amino acid receptors in the rat hippocampal slice increases intracellular Cl and cell volume〔J〕.J Neurochem，1998;71:1396404.