老年大鼠脑出血后BMP7 mRNA表达的动态变化

　　　　　　作者：谢逸群 杨期东 许宏伟 彭劲武

【摘要】 　　目的 初步了解骨形成蛋白（BMP）7对老年脑出血后神经修复的作用及其可能机制。方法 制作老年大鼠自体血脑出血模型（ICH），设正常对照组、模型组和假手术组，用RTPCR法分别观察BMP7 mRNA在脑出血后1、7、14、28 d脑内的动态表达。结果 模型组脑出血1 d时BMP7 mRNA表达降低(Ｐ<0.05)，7 d以后持续增高，一直到28 d仍高于正常对照（P<0.05）。结论 老年期ICH后不同时间BMP7mRNA的表达变化可能有助于神经修复。

【关键词】 骨形成蛋白7；脑出血；RTPCR

　　干细胞是目前脑血管病神经修复基础研究的热点之一。骨形成蛋白（BMPs）是一类与脑发育和神经发生关系密切的生长因子，其中BMP7可能通过调控分化神经干细胞（NSCs）对成年脑缺血大鼠产生神经保护作用〔1〕。但老年期脑损伤后BMP的变化及其与神经修复的关系尚未见报道。本研究拟通过观察老年大鼠脑出血模型BMP7 mRNA的动态表达，初步了解脑出血后BMP的变化及其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　体重280～330 g健康老年（24月龄）雄性SD大鼠共52只，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。

　　1.2 动物分组及处理

　　正常对照组12只大鼠。模型组24只大鼠。造模后再随机分为术后1、7、14、28 d共4个时间点进行观察，每个时间点各6只大鼠。用 RTPCR法观察脑内BMP7 mRNA的表达。假手术组16只大鼠，每个时间点4只，观察方法同模型组。

　　1.3 动物造模

　　参考Nakamura〔2〕的方法。将100 μl自体不抗凝血液缓慢注入尾状核内，制成脑出血模型。假手术组大鼠仅注入2 μl灭菌生理盐水，其他手术过程相同。

　　1.4 RTPCR法观察BMP7 mRNA的表达

　　参考Chen等〔3〕的方法，于各观测时间点迅速断头取脑，组织总RNA由Trizol法制备。cDNA合成后行PCR扩增。BMP7上游5′GAAAACAGCAGCAGTGACCA3′，下游5′GGTGGCGTTCATGTAGGAGT3′。以GAPDH为内参照，上游引物5′TGCTGAGATTGTCGTGGAG3′，下游引物3′TAGTGACGGTGAGTCTTCTG5′，PCR 的反应总体积为30 μl，含上述逆转录反应液2 μl，200 μmol/L dNTPs，10×Buffer 2.5 μl， 96℃ 3 min预变性后，94℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃60 s循环30次，反应产物置2%琼脂糖凝胶电泳，摄片，扫描半定量。

　　1.5 统计学方法

　　各组数据以x±s表示，组间样本两个均数比较用q检验；不同时相两样本均数比较用t检验。所有数据使用SPSS10.0统计软件进行处理。

　　2 结 果

　　正常对照组BMP7 mRNA表达丰度为1.53±0.26，与假手术组比较没有统计学差异（Ｐ>0.05）；大鼠脑出血后BMP7 mRNA 1 d时表达降低，丰度为1.30±0.19，与假手术组比较，差异显著（Ｐ<0.05)，7 d以后保持增高，一直到28 d仍明显增高，与假手术组、正常对照比较，（Ｐ<0.05），见表1，图1。表1 老年大鼠脑出血后BMP7 mRNA表达的动态变化(略)

　　3 讨 论
　　
　　BMP属于转化生长因子β（TGFβ）超家族成员，是精确调控胚胎脑皮质发育的主要营养因子之一。BMP7又称成骨蛋白１（OP１），能增加蛋白多糖的合成，启动软骨和骨的发生。在胚胎发育晚期以及成年后在大脑皮质、海马、纹状体、黑质等脑区都可以检测到BMP7 mRNA的表达〔3〕。有研究发现BMP7可促进成年后神经轴突的伸出，但也有研究表明BMP7不能促进神经轴突的生长，而是促进树突的生长〔4〕。Chang等〔1〕发现静脉或脑室内注射BMP7蛋白可改善成年脑缺血大鼠的神经功能，提示外源的BMP7的神经保护作用。Wang等〔5〕研究表明，在一定的剂量范围内不会影响肝、肾、胰腺等脏器的正常功能状态，其机制尚不清楚。
　　
　　研究表明，BMP7 mRNA在正常成年大鼠多个脑区都有较高水平的表达〔6〕，而且即使是老年鼠脑内BMP7 mRNA的表达也不见降低。对脑损伤后神经修复的研究发现脑缺血或脑外伤可以上调BMP7 mRNA和BMP受体ⅡmRNA的表达〔7〕，本研究中BMP7 mRNA在ICH后1 d时表达低于正常，结果与袁治国等〔8〕有关脑缺血的报道相似，而与Chang〔1〕的报道不一致。Yangisawa等〔9〕给成年大鼠注射6羟基多巴胺后， 脑内BMP7 mRNA的表达降低，认为这可能是黑质细胞死亡后BMP7 mRNA合成减少的缘故。本研究中，大鼠脑出血后BMP7 mRNA 1 d时表达降低，可能与ICH后相关合成细胞大量死亡相关，也有可能是缘自某种原因的自我保护性下调。有研究发现内源BMP7有抑制神经发生的作用〔11〕，脑内给予外源性BMP7干预后，ICH早期也未见神经功能的明显改善，提示ICH后1 d时BMP7 mRNA表达的降低可能仍然有保护性意义。当然ICH的早期，神经功能受损有很多方面的因素，包括血肿占位效应、脑水肿、代谢营养障碍等，而且短期内（数日）NSCs的增殖，在有效的神经联系尚未建立之前，可能不会带来明显的功能改善效益。7 d以后BMP7 mRNA上调，并持续到28 d以后，推测其对神经修复可能有积极作用。这种上调的原因之一可能是ICH后大量神经胶质细胞增生代偿的结果。

参考文献

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　　3 Chen HL，Lein PJ，Wang JY，et al.Expression of bone morphogenetic proteins in the brain during normal aging and in 6hydroxydopaminelesioned animals〔J〕.Brain Res，2003；994(1):8190.

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　　5 Wang Y，Chang CF，Morales M，et al.Bone morphogenetic protein6 reduces ischemiainduced brain damage in rats〔J〕.Stroke，2001;32(9):21708.

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　　7 Setoguchi T，Yone K，Matsuoka E，et al.Traumatic injuryinduced BMP7 expression in the adult rat spinal cord〔J〕.Brain Res，2001;921(12):21925.

　　8 袁治国，王俊科.BMP7 mRNA在大鼠缺血/再灌注心肌和脑中表达的变化〔J〕.中国医科大学学报，2003;32(6):4967.

　　9 Yanagisawa M，Takizawa T，Ochiai W，et al.Fate alteration of neuroepithelial cells from neurogenesis to astrocytogenesis by bone morphogenetic proteins〔J〕.Neurosci Res，2001;41(4):3916.

　　10 Aberle H，Haghighi AP，Fetter RD，et al.Wishful thinking encodes a BMP type Ⅱ receptor that regulates synaptic growth in Drosophila〔J〕. Neuron，2002;33(4):54558.