高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预作用

　　　　　　 作者：林炜炜 刘德山 李伟 常萍

【摘要】 　　目的 研究高糖环境对体外培养的大鼠海马神经元乏氧损伤时凋亡的影响以及脑神康胶囊对损伤神经元的保护作用。方法 原代培养大鼠海马神经元，将细胞随机分成8组：对照组、高糖组、黄嘌呤（X）/黄嘌呤氧化酶（XO)组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低、中、高剂量组。干预后测细胞存活率及凋亡率，采用Realtime PCR法检测各组海马神经元HIF1α mRNA、Bcl2 mRNA和Bax mRNA的表达及Bc2/Bax比值。结果 与对照组相比，高糖组及X/XO组神经元存活率、Bcl2 mRNA表达水平和Bcl2/Bax的水平均显著下降，神经元凋亡率、HIF1α mRNA和Bax mRNA表达水平均显著升高(均P<0.01)；与X/XO组比较，川芎嗪组及脑神康各浓度组神经元存活率、Bcl2 mRNA表达和Bcl2/Bax的水平均明显上升，而神经元凋亡率、HIF1α mRNA和Bax mRNA表达均明显下降。结论 脑神康胶囊能够明显抑制高糖环境下大鼠海马神经元的凋亡，对高糖环境下海马神经元的乏氧损伤有保护作用，其作用机制之一是下调HIF1α mRNA表达、上调Bcl2 mRNA表达、改善乏氧环境及抗细胞凋亡。

【关键词】 海马神经元；高糖；凋亡；黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶；脑神康胶囊

　　【Abstract】Objective To research the effect of Naoshenkang capsule on expression of hypoxiainducible factor1 alpha (HIF1α) of oxidative damaged rat hippocampal neurons in high glucose. Methods The primarily cultured neonate rat hippocampal neurons were randomly pided into eight groups: control， high glucose， xanthine/xanthine oxidase (x/xo)， ligustrazine， normal sodium and the small， middle， and large dosage of Naoshenkang groups. The rate of cell survival and apoptosis were measured， and the method of realtime PCR was used to detect the mRNA expression of HIF1α， Bcl2， Bax. Results The survival rate， the expression of Bcl2 mRNA and the ratios of Bcl2 and Bax in the high glucose group were lower， but apoptosis and the expression of HIFlα and Bax mRNA higher than those of x/xo group (P＜0.01). The survival rate， the expression of Bcl2 mRNA and the ratios of Bcl2 and Bax in the ligustrazine group and all Naoshenkang groups were significantly higher， but apoptosis and the expression of HIFlα and Bax mRNA lower than those of x/xo group. Conclusions Naoshenkang capsule can significantly inhibit the apoptosis of rat hippocampal neurons in the high glucose， and make a protective effect on hypoxia injury. Its mechanism may be that Naoshenkang capsule can downregulate HIFlα mRNA expression， upregulate Bcl2 mRNA expression， improve the hypoxia and resist apoptosis.

　　【Key words】 Hippocampal neurons; High glucose; Apoptosis; Xanthine/xanthine oxidase; Naoshenkang capsule

　　高血糖可引起神经传导速率下降和神经纤维变性，其神经系统的损害除表现在周围神经和自主神经系统外，亦可累及中枢神经系统〔1〕，出现糖尿病脑功能损害〔2〕，这主要是由于高糖所引发的神经细胞的凋亡所致。目前已有较多文献报道了细胞凋亡与周围神经病变的密切关系〔3，4〕，但少见细胞凋亡与脑功能损害的关系报道。 本课题组前期研究了脑神康胶囊对乏氧海马神经元凋亡蛋白表达的影响，结果提示糖尿病引起的海马神经元凋亡可能与乏氧有关〔4〕。本实验旨在观察高糖状态对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响，并研究脑神康胶囊的干预作用及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　成年雄性Wistar大鼠，出生24 h之内的Wistar新生鼠均由山东大学实验动物中心提供，大鼠生产许可证号SCXK（鲁）20030004。

　　1.1.2 药品及试剂

　　脑神康胶囊由生黄芪、熟地、黄精、川芎、枸杞子、淫羊藿、苍术、野葛根、黄连等组成，由山东大学齐鲁医院制剂室提取制备，每克相当于生药3.564 g，用蒸馏水配制成5%水溶液备用。盐酸川芎嗪注射液购自山东潍坊制药厂有限公司，批号：030618；胰蛋白酶、多聚赖氨酸、葡萄糖、无水甘露醇、四甲基偶氮唑盐(MTT)、黄嘌呤（X）和黄嘌呤氧化酶（XO）、阿糖胞苷购自Sigma；低糖型DMEM、DMEM/F12、高糖型DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Trizol购自上海生工生物工程技术服务有限公司）；TaKaRa逆转录试剂盒和SYBR Green购自大连宝生物工程有限公司；毛细管购自Roche公司，所有引物均由上海Invitrogen公司合成。其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 含药血清的制备

　　30只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组6只，第1、2、3组分别给予脑神康低（5 ml/kg）、中（10 ml/kg）、高浓度（20 ml/kg）灌胃，第4组给予盐酸川芎嗪注射液40 mg/kg腹腔注射，第5组给予同等量生理盐水灌胃，以上操作均2次/d ，连续3 d。第3天末次给药1.5 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌剖腹，下腔静脉取血，凝后3 000 r/min离心8 min，分离血清，56℃灭活30 min，分装，-20℃保存备用。

　　1.2.2 原代培养细胞

　　出生24 h之内的Wistar新生鼠，无菌条件下分离出双侧海马，剥除脑膜及结缔组织，剪为1 mm3的小块，置含有0.125%胰蛋白酶的PBS中，37℃消化15 min，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰蛋白酶的作用，轻轻吹打，使组织分散成单细胞悬液，并经200目不锈钢筛过滤，以1×106/L 的密度接种于经0.1 g/L多聚赖氨酸处理过的6孔板中，置37℃、5% CO2的培养箱中培养，并于接种的第3天加入阿糖胞苷(终浓度为10 mg/L)作用24 h以抑制胶质细胞的增殖。此后每3天半量换液。

　　1.2.3 氧化损伤模型制备

　　取原代培养的大鼠海马神经元在高糖环境和非高糖环境下培养至第8天的神经细胞用于实验，随机分为以下8组：对照组（5.5 mmol/L DMEM培养液），高糖组（25 mmol/L DMEM培养液）、X/XO组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低浓度组、脑神康中浓度组、脑神康高浓度组。对照组继续培养，X/XO组：加入终浓度为1 mmol/L的X 和20 U/L的XO产氧体系，作用45 min后换无血清高糖培养基培养，12 h后测指标。高糖组：换无血清高糖培养基培养，12 h后测指标。余5组分别将川芎嗪、生理盐水、脑神康低浓度、中浓度、高浓度提前加入培养基内作用30 min，后加入X/XO体系作用45 min后换无血清高糖培养基培养，12 h后测指标。

　　1.2.4 MTT法测定细胞代谢率

　　将细胞以1×105/孔接种于96孔板，每孔加入10 μl MTT (终浓度为0.5 g/L)，对照孔不作处理，4 h后，终止培养，吸去上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，平行振荡10 min，用酶标仪在490 nm处测定OD值。神经元存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%。

　　1.2.5 流式Annexin/PI双染法测细胞凋亡率

　　参照试剂盒操作说明，以0.25%胰酶消化细胞，用PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min，收集1×105个细胞，使用500 μl Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl AnnexinVFITC及5 μl PI，混匀，室温避光反应15 min，1 h之内流式细胞仪检测。

　　1.2.6 RealTime PCR法检测bcl2、bax和HIF1α mRNA的表达

　　参照Trizol说明书提取细胞总RNA，用分光光度计测定浓度之后，按照TaKaRa说明书将RNA逆转录成cDNA。PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反应产物专一，没有二聚体等杂带的样品进行下一步定量PCR反应。以GAPDH 和βactin 为内参。PCR引物序列见表1。以目的基因HIF1α与内参GAPDH，目的基因Bcl2、Bax与内参βactin的比值代表该样品PCR产物的相对含量。表1 RealTime PCR定量分析引物设计（略）

　　1.3 统计学处理

　　实验结果采用SPSS16.0软件分析，数据以x±s表示，两组间计量资料的比较采用t检验和方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组海马神经元存活率及凋亡率检测结果

　　与对照组相比，高糖组及X/XO组神经元存活率明显下降，凋亡率显著升高(均P<0.01)；与高糖组相比，X/XO组神经元存活率显著下降，凋亡率显著升高(P<0.05)；与X/XO组比较，川芎嗪组及脑神康各浓度组神经元存活率上升，凋亡率明显下降。其中脑神康中浓度组细胞存活率最高，凋亡率最低，具统计学意义(P<0.05)，川芎嗪组与低浓度组接近，无统计学差异(P>0.05)，见表2。表2 各组大鼠海马神经元存活率及凋亡率测定结果比较（略）

　　2.2 实时荧光定量PCR测定结果

　　与对照组相比，高糖组及X/XO组Bcl2 mRNA表达和Bcl2/Bax比值明显下降，HIF1α mRNA和Bax mRNA表达水平明显升高(均P<0.01)；与高糖组相比，X/XO组Bcl2 mRNA表达和Bcl2/Bax比值明显下降，HIF1α mRNA和Bax mRNA表达明显升高(均P<0.05)；与X/XO组比较，川芎嗪组及脑神康各浓度组Bcl2 mRNA表达和Bcl2/Bax比值明显上升，而HIF1α mRNA和Bax mRNA表达明显下降。其中脑神康中浓度组差异最明显，具有统计学意义(均P<0.05)，川芎嗪组与低浓度组接近，无统计学差异(P>0.05)，见表3，图1。表3 各组大鼠海马神经元Bcl2 mRNA，Bax mRNA及其比值的比较（略）

　　3 讨 论

　　糖尿病高血糖直接致红细胞内血红蛋白糖化增加、2，3二磷酸甘油酯(2，3DPG)产生减少、血红蛋白与氧的亲和力增强，引起组织缺氧。在组织缺氧的代偿过程中，伴随着微循环功能改变，隐匿地发生糖尿病微血管病变(DMA)，长期组织缺氧参与促使DMA进行性发展。因此，缺氧是DMA的重要发病机制之一。DMA主要表现在视网膜、肾、心肌、神经组织及皮肤等。Chavez等〔5〕认为在乏氧条件下，神经组织的HIF1α基因表达迅速增加，乏氧可能是糖尿病神经病变形成的基本病理因素。根据这些研究结果，认为糖尿病海马等脑组织可能同样存在微环境的变化，进而影响凋亡蛋白的表达，引起脑功能的损害。而在体外25～30 mmol/L葡萄糖浓度近似于糖尿病时体内的高糖状态〔6〕。有研究表明，高血糖能产生过多的NO，NO通过环磷酸鸟苷(cGMP)或非cGMP依赖方式作用于细胞凋亡基因，启动凋亡程序〔7〕。细胞凋亡是一个多基因调控的过程，Bcl2是研究最早的与细胞凋亡有关的基因，它可抑制多种形式的细胞凋亡，其抑制细胞凋亡的机制可能是Bcl2通过抗氧化剂作用抑制自由基，或者通过改变细胞内Ca2+流动而抑制细胞凋亡。Bax则与Bcl2作用相反，可加速细胞的凋亡。Bc12与Bax形成同源二聚体，其蛋白水平的高低与细胞凋亡的调控直接相关。Bcl2和Bax调节细胞凋亡不仅取决于自身表达的高低，还与Bcl2/ Bax比值有关。Bcl2/ Bax比值是影响细胞凋亡的关键，其比升高加则抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡。

　　HIF1是细胞在乏氧时诱导表达的最关键的核转录因子，也是乏氧时调控细胞凋亡的重要因素〔8〕。它是一个由HIF1α和HIF1β组成的异二聚体。HIF1的生物效应主要取决于HIFlα亚基的蛋白质水平和活性〔9〕。正常情况下，HIFlα不表达或表达很少，而在缺氧状态下，HIFlα的表达可呈时间和缺氧程度的依赖性升高，HIFlα蛋白的表达量和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节〔10，11〕。目前研究发现HIFlα可发挥多方面的效应：上调VEGF表达以促进血管生成；诱导iNOS、血红素氧化酶(HO1)的表达，发挥扩张血管的作用；诱导糖酵解基因表达以促进无氧代谢；诱导细胞凋亡，减少神经细胞数量〔10，11〕；激活EPO基因的表达使红细胞生成增加，提高携氧能力，从而使缺氧的组织细胞保持氧稳定和耐受低氧状态〔12〕。有研究显示，HIF1表达与Bcl2呈负相关〔13〕，特别是当细胞严重或长时间缺氧时，其保护性反应丧失而引起凋亡。本实验用X与XO体系来造成乏氧损伤，它是产生氧自由基的体系，而氧自由基进一步启动Haberweiss反应生成毒性更强的羟自由基，这些自由基可以攻击细胞膜，并可以造成许多大分子如核酸、蛋白质损伤，最终导致神经细胞的损伤。

　　本研究结果显示，高糖本身能够引起组织轻度乏氧，诱导HIF1α mRNA表达，也可以显著增强乏氧诱导细胞的凋亡水平。X/XO损伤可以引起海马神经元明显乏氧与凋亡，Bax mRNA和HIF1α mRNA表达量显著升高，而Bcl2 mRNA的表达以及Bcl2/Bax的比值明显下降；而脑神康各浓度组和川芎嗪组均能显著提高高糖环境下损伤的海马神经元的存活率，降低其凋亡率，上调Bcl2 mRNA的表达以及Bcl2/Bax的比值并且下调Bax mRNA和HIF1α mRNA的表达，对海马神经元的损伤有明显的保护作用。其中脑神康中、高浓度组作用最明显，脑神康低浓度组作用与川芎嗪组相当，提示中药脑神康可以改善高糖和乏氧损伤引起的海马神经元的凋亡，提高细胞存活率，对糖尿病脑部损害有保护作用，这种保护作用可能是通过上调抗凋亡基因Bcl2 mRNA和下调HIF1α mRNA的表达而实现的。脑神康方主要由生黄芪、熟地、黄精、川芎、枸杞子、淫羊藿、苍术、野葛根、黄连等中药组成，具有益气补肾，生精填髓之功效，以前的实验和临床均证明其具有降血糖、抑制海马神经元凋亡、健脑益智的作用。从川芎中提取的川芎嗪，可抑制黄嘌呤氧化酶(XO)的活性并且抑制HIF1α的表达〔14〕。而黄芪、熟地、黄精、枸杞子等均具有降血糖、抗自由基过氧化、扩血管、改善微循环、提高机体免疫功能等作用。因此，中药脑神康改善乏氧损伤的海马神经元的凋亡是有其药理学基础的。

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