大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路及凋亡调控因子的增龄变化

　　　　　　 作者：李雅莉 赵宁 张丽 李林

【摘要】 目的 观察大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中重要因子和调控凋亡相关因子的增龄变化及与老化的关系。方法 按月龄将雄性SD大鼠分为1、3、6、12、18、24月龄6组。应用免疫组织化学染色和Western印迹法观察增龄大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中的转导因子PI3K、pp70S6K、磷酯化环腺苷酸应答元件结合蛋白(pCREB)及凋亡调控因子Bax和Bcl2的表达情况。结果 大鼠脊髓腰节段神经元pp70S6K和pCREB随增龄变化明显，1月龄时表达量较低，3月龄时有所增高，至6月龄、12月龄达高峰，24月龄时明显减低；而PI3K的变化不大。大鼠脊髓腰节段Bax表达随年龄增高逐渐增加，至24月龄表达量达高峰；Bcl2表达随年龄增加而逐渐降低，至24月龄时降至最低点。与6月龄（青年期）大鼠相比，24月龄（老年期）大鼠脊髓腰节段神经元pp70S6K、pCREB和Bcl2表达明显降低，Bax表达显著增高。结论 老年大鼠脊髓腰节段pp70S6K、pCREB和Bcl2的表达明显降低， Bax表达显著增多，提示脊髓老化与神经元存活信号转导通路和凋亡调控因子的变化有关。

【关键词】 脊髓；老化；神经元存活信号转导通路；细胞凋亡

　　【Abstract】 Objective To investigate the changes in neuronal survival signal transduction pathway and apoptosis regulating factors in the lumbar spinal cord of ageincreasing rats， and to evaluate their correlation with aging. Methods Male SD rats were pided into 1， 3， 6， 12， 18 and 24monthold groups according to their age. The expressions of important factors in neuronal survival signal transduction pathway (PI3K， pp70S6K， pCREB) and apoptosis regulating factors (Bax， Bcl2) in the lumbar spinal cord of rats were measured by immunohistochemistry and Western blot. Results The expressions of pp70S6K and pCREB in the lumbar spinal cord was lower in 1monthold rats， increased at the age of 3 months， reached the peak in 6 and 12monthold rats， and decreased to the lowest level at the age of 24 months; but PI3K did not show significant changes. The expression of BAX was increased with age increasing， and reached the peak at the age of 24 months. The content of Bcl2 was reduced with ageing， and dropped to the bottom in 24monthold rats. Compared with those in young rats (6 month old)， the expressions of pp70S6K， pCREB and Bcl2 were decreased and the content of Bax was increased significantly in the lumbar spinal cord of aged rats (24 month old). Conclusions Aged rats show a decrease in the expressions of pp70S6K， pCREB and Bcl2， and an increase in the content of Bax in the spinal cord， suggesting that aging of spinal cord is related to the changes in survival signal transduction pathway and apoptosis regulating factors.

　　【Key words】 Spinal cord; Aging; Signal transduction; Apoptosis

　　目前对于增龄的研究多见于海马、心肌、学习记忆〔1～3〕等，与脊髓老化的相关研究甚少。神经营养因子的后信号转导通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) /蛋白激酶B (PKB 或Akt)及其下游激酶磷酸化P70核小体S6 激酶(pp70S6K)信号转导通路是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要信号转导通路，也是神经细胞存活的重要信号转导通路〔4〕。通过上调神经元存活信号转导通路中的重要因子可以干扰凋亡级联反应和促进神经元生存，从而阻止因衰老导致的细胞凋亡。本研究观察了6个不同年龄段大鼠的脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中重要因子PI3K、pp70S6K和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（pCREB）的增龄变化，以及细胞凋亡调控因子Bax和Bcl2表达的变化，以探讨脊髓老化的可能机制，并评价增龄对信号转导通路和凋亡相关因子的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　Sprague Dawley (SD)大鼠，雄性，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物分级为无特定病原体 (specific pathogen free，SPF) 级，合格证号：SCXK(京20020001)。

　　1.2 试剂

　　PI3K抗体、pp70S6K抗体、pCREB抗体、Bax抗体、Bcl2抗体、βactin抗体、封闭用正常羊血清原液、抗体稀释液、生物素标记的兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲合素、DAB显色试剂盒，均购自中杉金桥生物技术公司；Tris碱、丙烯酰胺、N，N′亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、DTT、过硫酸胺、溴酚兰、EDTA、苯甲基磺酰氟、亮抑制肽、牛血清白蛋白（BSA），均购自美国Sigma公司；TEMED、二甲基甲酰胺、预染标准分子量蛋白质，购自美国Gibco BRL公司；浓缩显影液、浓缩定影液购自乐凯公司。

　　1.3 主要仪器

　　620E型冷冻切片机（英国Shandon公司）；CHK213型光学显微镜、BX51型生物显微镜（日本Olympus公司）；Imagepro Plus 4.0图像分析系统（美国）；PowerPac200型稳压稳流电泳仪、PowerPac200型湿转电泳仪(美国BioRad公司)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 动物分组

　　大鼠按不同月龄分为6组：1月龄、3、6、12、18和24月龄，每组3只置于SPF环境即屏障系统中饲养。

　　1.4.2 免疫组织化学染色检测

　　大鼠灌杀后完整取出脊髓腰节段，连续冠状面切片，厚度40 μm。每只大鼠各取位置相同的3张脊髓片，用3% h3O2室温孵育10 min；磷酸盐缓冲液（PBS）洗5 min，洗3次；10%羊血清室温封闭30 min，PBS洗5 min，洗3次；分别加入不同的一抗（PI3K抗体、pp70S6K抗体、Bax抗体）孵育，PBS洗5 min，洗3次；加入生物素标记的兔二抗，室温孵育2 h，PBS洗5 min，洗3次；加入HRP标记的三抗，孵育1 h，PBS洗5 min，洗3次；DAB工作液显色，显微镜下控制染色程度；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察。阴性对照：分别以PBST和非免疫正常血清代替一抗进行免疫组化染色，其余步骤同前。

　　1.4.3 Western印迹检测

　　参照SturchlerPierrat等的方法。取大鼠脊髓腰节段，称重，以1∶5比例加入预冷的组织裂解液，匀浆制备样品，低温高速离心12 000 r/min，取上清液。用Folin酚法测定蛋白浓度，调节各样品蛋白浓度统一为5 g/L，加2×上样缓冲液，100℃沸水浴变性5 min。分离胶为15% SDSPAGE凝胶，电泳缓冲液为Tris甘氨酸，上样量50 μg/孔。恒压60 V电泳至溴酚兰到达分离胶后，加大电压至120 V，溴酚兰到达分离胶底部时，结束电泳。冰浴中90 V转膜120 min，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。分别加入不同的一抗（PI3K抗体、pCREB抗体、Bax抗体、Bcl2抗体、βactin抗体），室温2 h；加入HRP标记的二抗，室温1 h；ECL法显示特异条带。用扫描仪将胶片的图像转入计算机中。使用Image J凝胶成像分析系统，对各个条带的整合灰度进行分析。将胶片上的6月龄组（青年组）所对应条带的整合灰度值设定为100％，计算出其他各组对应条带的整合灰度值与6月龄组的相对百分比。

　　1.5 统计学分析

　　使用SPSS11.5软件进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），数据以x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中相关因子表达的增龄变化

　　2.1.1 免疫组织化学法检测结果

　　大鼠脊髓腰节段PI3K表达量在1月龄和3月龄时较低，从6月龄时开始明显增高，12月龄和18月龄时达高峰，24月龄时略下降，但无统计学意义。pp70S6K表达量开始随年龄增高逐渐增加，至6月龄（青年期）表达量达高峰，并维持至12月龄，在18月龄时明显减少，至24月龄（老年期）时表达量最低。见表1。表1 增龄大鼠脊髓腰节段PI3K和pp70S6K表达的变化（免疫组化染色）(略)

　　2.1.2 Western印迹法检测结果

　　大鼠脊髓腰节段PI3K表达量在6月龄和12月龄时最高，24月龄（老年期）时的表达量与6月龄（青年期）相比有所下降，但无统计学意义。大鼠脊髓腰节段pCREB表达量在1月龄和3月龄时较低，6月龄达高峰，然后逐渐下降，24月龄时表达量最低。见图1，表2。表2 增龄大鼠脊髓腰节段PI3K和pCREB的表达(略)

　　2.2 大鼠脊髓腰节段细胞凋亡调控因子的增龄变化

　　2.2.1 免疫组织化学法检测结果

　　大鼠脊髓腰节段Bax表达量随年龄增高逐渐增加，至24月龄（老年期）表达量达高峰， 24月龄与6月龄（青年期）相比表达量显著增，见表3。表3 增龄大鼠脊髓腰节段Bax及Bcl2表达的变化(略)

　　2.2.2 Western印迹法检测结果

　　大鼠脊髓腰节段Bax表达的增龄变化趋势与免疫组织化学染色基本相符；与6月龄（青年期）大鼠相比，24月龄（老年期）大鼠的Bax表达量显著增多。大鼠脊髓腰节段Bcl2的表达量随年龄增加而逐渐降低，至24月龄时降至最低点，与6月龄组相比差异显著。见图2，表3。
图2 大鼠脊髓腰节段Bax和Bcl2表达的增龄变化

　　3 讨 论

　　脊髓神经元的存活是维持脊髓功能的基础，研究发现激活PI3K是抑制细胞凋亡的初级信号。许多神经营养因子都是通过与受体结合后，激活对支持细胞存活发挥最重要作用的PI3K/Akt信号通路，调节细胞的增殖和存活。神经营养因子与相应受体激活PI3K/Akt级联反应后，Akt进一步激活下游的靶分子p70S6K，最终使CREB磷酸化，启动基因转录程序，发挥抑制细胞凋亡、保护细胞、促进神经元存活的生物学作用〔5〕。

　　Akt/p70S6K信号通路是神经细胞存活的重要途径。Akt除了通过BadBcl2通路调节细胞生长和增殖外，还可通过细胞核内信号转导通路直接作用于CREB，引起特定基因的表达。在生理状态下，CREB在多种刺激因素作用下被激活，参与真核生物靶基因的转录调控，发挥许多生物学效应，包括生长因子依赖的神经元的存活。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad，FKHR，GSK3，caspase9，NFκB等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移〔6〕。其底物的多样性说明了Akt 在细胞增殖、细胞分化和细胞存活中的广泛作用〔7〕。

　　本研究显示，神经元存活信号转导通路中重要因子PI3K、pp70S6K和pCREB在增龄大鼠脊髓腰节段的表达水平不完全一致。PI3K是观察的第1个细胞内信号转导蛋白质，自6月龄（青年期）开始PI3K升至一个较稳定的水平，24月龄（老年期）轻度下降。pp70S6K则表现为典型的青年期之前随增龄而增加，青年期和中年期（6月龄和12月龄）表达量最高，以后逐渐下降，老年期表达量最少，符合老年期蛋白质的翻译功能减弱、核糖体的生物合成下降、细胞周期及增殖、分化等均发生变化的特点。pCREB的表达水平在青、中年期最高，老年期明显下降，也说明老年期核转录因子减少。研究结果显示，在神经元存活信号转导通路上游和下游的因子在脊髓老化过程中明显下调。

　　Bcl2家族是一个重要的凋亡调节蛋白家族，包括促凋亡因子Bad、Bax、Bak，以及抗凋亡因子Bcl2、BclXl、Mcl1等。Bcl2基因是调节细胞凋亡最基本的成员，被认为是能特异地抑制凋亡发生的“抗凋亡基因”。提高Bcl2的表达水平，不仅可以保护神经元对抗不同的损伤因素，而且能促使哺乳动物神经系统轴突再生。Bcl2调节着神经营养因子依赖的神经元存活〔8〕，破坏Bcl2将导致神经元致死性的损伤〔9〕。

　　神经元内Bcl和Bax的比例与神经元的存活与否有关，比例高则神经元趋于存活，反之则趋于凋亡。尽管细胞内Bcl2/Bax的比例固定，但外界刺激可以改变抑制凋亡的Bcl2Bax与促进凋亡的BaxBax的量发生改变。Bcl2和Bax可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。随着Bcl2表达增多，BaxBax分开，形成Bcl2Bax异源二聚体，中和了BaxBax促进凋亡作用。脊髓的Bax免疫反应阳性细胞集中于Ⅱ板层。而这些细胞所接受的前一站神经元如脊神经节、三叉神经节等也表达Bax蛋白〔10〕。

　　本研究观察到促凋亡因子Bax在大鼠脊髓腰节段的表达随增龄而增加，老年期（24月龄）Bax的表达与青年期（6月龄）相比显著增多，而抑制凋亡因子Bcl2在老年期的表达与青年期相比显著减少，推测可能是由于老年期神经营养因子和神经元存活通路中相关因子的表达降低，导致Bax表达升高，Bcl2表达降低，其结果可能引起老年期脊髓神经细胞凋亡增多。

　　本研究对1、3、6、12、18、24月龄大鼠脊髓腰节段的神经元存活通路相关因子和调控凋亡相关因子进行了观察，发现大鼠脊髓的神经元存活通路相关因子pp70S6K、pCREB和调控凋亡相关因子Bax、Bcl2均存在着随增龄的变化，提示上述因子有可能作为脊髓老化和脊髓损伤的检测指标，并可为进一步开发抗脊髓老化和脊髓损伤药物提供新的靶点。

参考文献

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　　8 Riccio A，Ahn S，Davenport CM，et al.Mediation by a CREB family transcription factor of NGFdependent survival of sympathetic neurons〔J〕. Science，1999；286(5448):235861.

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　　10 Vekrellis K，Mccarthy MJ，Watson A，et al.Bax promotes neuronal cell death and is downregulated during the development of the nervous system〔J〕.Development，1997；124(6)：123949.