关于IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用

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　　　　　　　　　　 作者：祝畅 刘志恒 张传汉 桂伶俐 姚文龙

【摘要】 目的：检测在缺氧缺糖环境中，IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株（INPCs）NFκB的活性、细胞存活及细胞损伤的影响. 方法: 在建立转染pcDNA3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的基础上，用MTT法检测缺氧缺糖处理3，6和9 h后两细胞株的存活率，用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6 h前后NFκB的活性，并测定缺氧缺糖6 h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量，用Hoechst33342染色观察细胞核的形态. 结果：转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs 中NFκB的活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs，缺氧缺糖6 h或9 h时，前者存活率高于后者，且6 h时前者上清中的乳酸脱氢酶释放量较少，缺氧缺糖可使两细胞株的部分细胞核呈现凋亡改变. 结论：IκBα突变型基因可降低INPCs中NFκB的活性， 提高INPCs在缺氧缺糖处理后的存活率， 减轻细胞损伤.
【关键词】 干细胞； NFκB抑制因子α； 细胞缺氧
　　【Abstract】 AIM: To determine the effect of mutated IκBα gene on immortalized neural progenitor cell strains (INPCs) in oxygenglucose deprivation. METHODS: After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 3， 6 or 9 h respectively. MTT staining was used to detect the survival rate of the two cell strains. Luciferase assay system was used to detect the activity of NFκB in pcDNA3.1 transfected or pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs. Lactate dehydrogenase in culture medium was measured after the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6 h. The morphological change of two cell strains was observed by Hoechst33342 staining. RESULTS: The activity of NFκB was downregulated in pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs before or after oxygenglucose deprivation. The cell survival rate of pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs was higher than that of pcDNA3.1 transfected INPCs after exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6 h or 9 h， but there was no difference in cell survival rate at 3 h. After the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6 h， lactate dehydrogenase content in culture medium was lower in pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs. Hoechst33342 staining revealed that cells were apoptotic after oxygenglucose deprivation. CONCLUSION: By downregulating the activity of NFκB， mutated IκBα gene improves the cell survival rate of INPCs and lessens the cell damage caused by oxygenglucose deprivation.
　　【Keywords】 stem cells; NFkappaB inhibitor alpha; cell hypoxia
　　0 引言
　　
　　我们实验室已成功构建了转IκBα突变型基因永生化大鼠神经前体细胞株（immortalized neural progenitor cell strain， INPCs）［1］，并证实该细胞株中IκBα突变型基因可下调NFκB的活性，使部分炎性细胞因子的表达减少. 由于NFκB的作用广泛且复杂，其活性的变化在不同细胞及不同刺激情况下所引发的效应不同［2］. 我们拟检测在正常及缺氧缺糖培养条件下，转染IκBα突变型基因及对照载体的INPCs 细胞存活及受损的情况，为进一步探讨IκBα突变型基因影响细胞活性的可能机制和转染IκBα突变型基因INPCs的应用前景奠定基础.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，NFκB荧光素酶报告质粒6×κB由德国Heike L Pahl教授惠赠. DMEM/F12培养基， B27无血清培养添加剂， 脂质体lipofectamineTM2000（美国Gibco公司）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)（英国Pepro Tech公司）； MTT，hoechst33342（美国Sigma公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；酶标仪（美国BioRad公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 MTT法检测细胞存活率 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs置无血清培养基培养，培养基成分为：DMEM/F12培养基添加bFGF，EGF各20 μg/L，1×B27，青、链霉素各1×105 U/L，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔0.1 mL，每株细胞每板接种24孔，共种4板，置37℃ 50 mL/L CO2培养箱培养24 h后留一板作为对照组，其余3板作为实验组，将实验组培养液换为无糖Earles液后，利用三气水套式培养箱，充以N2，使O2浓度维持在30 mL/L，CO2浓度为50 mL/L，分别处理3，6和9 h，然后将4板的培养液均换为DMEM/F12培养基，加入0.02 g/L MTT 50 μL/孔，继续在37℃ 50 mL/L CO2条件下培养4 h，吸去上清液，加入150 μL/孔DMSO，震荡混匀，在酶标仪上测定A570 nm，以对照组的细胞存活率为100%， 以细胞存活率=实验组A570 nm/对照组A570 nm×100%计算细胞存活率.
　　1.2.2 NFκB荧光素酶报告基因的检测 用脂质体转染法将含有NFκB启动荧光素酶报告基因的质粒6×κB分别转入等细胞密度的稳定转染pcDNA3.1的INPCs及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs中，48 h后将一批细胞置原培养环境，另一批细胞按上述缺氧缺糖条件处理6 h，根据荧光素酶检测试剂盒说明操作，以荧光强度来表示NFκB活性.
　　1.2.3 乳酸脱氢酶的检测 分别将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以1×106/孔的密度接种于6孔板，共种2板，接种24 h后，一板按上述缺氧缺糖条件处理6 h，另一板将培养液换为DMEM/F12培养基，置正常培养环境培养6 h，分别取上清，离心除去沉淀后，用全自动生化仪测定上清中乳酸脱氢酶的含量.
　　1.2.4 细胞核形态的观察 将经缺氧缺糖处理6 h和正常培养状态下的转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs用甲醇固定15 min，加入终浓度5 mg/L的Hoechst33342避光反应10 min，荧光显微镜观察细胞核形态.
　　
　　统计学处理：采用SPSS 12.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，不同细胞间比较采用成组t检验， P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 细胞存活率的检测 各处理时点转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs存活率见表1，缺氧缺糖3 h，两细胞株存活率差异无统计学意义，缺氧缺糖6 h和9 h时，转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs存活率高于转染pcDNA3.1的INPCs，差异具有统计学意义（P&<0.05）.
　　表1 缺氧缺糖处理后转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的永生化大鼠神经前体细胞株存活率（略）
　　bP&<0.01 vs pcDNA3.1 INPCs处理6 h； cP&<0.05 vs pcDNA3.1 INPCs处理9 h.
　　2.2 细胞核形态的观察 荧光显微镜下观察细胞核形态的变化，转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs处理前，细胞核形态正常，缺氧缺糖处理6 h后，有部分细胞出现染色质浓缩、边缘化等凋亡特征性改变（图1），但两组细胞呈凋亡改变的细胞计数差异无统计学意义(P&<0.05).
　　A：转染pcDNA3.1INPCs处理前；B：转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs处理前；C：转染pcDNA3.1INPCs缺氧缺糖处理6 h；D：转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs缺氧缺糖处理6 h.
　　图1 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的永生化神经前体细胞株缺氧缺糖前后细胞核形态（箭头所示为核固缩细胞） Hoechst ×200（略）
　　2.3 乳酸脱氢酶检测 等细胞密度的转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs，在缺氧缺糖处理6 h后，上清中的乳酸脱氢酶分别为（391±33） μL和（247±14） μL，两者比较P=0.002，差异具有统计学意义(P&<0.05).
　　2.4 NFκB荧光素酶报告基因的检测 以受NFκB调控转录的荧光素酶催化底物所发出的荧光强度代表NFκB的活性，转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在不给予缺氧缺糖处理时，NFκB活性分别为7828±231和1924±185，两者比较差异具有统计学意义（P&<0.05）. 缺氧缺糖处理6 h后，NFκB活性分别为1101±50和744±27，两者比较差异有统计学意义（P&<0.05）.

　　3 讨论
　　
　　神经前体细胞具有不断分裂增殖、自我更新以及多分化潜能［3］，可作为中枢神经系统修复的细胞来源和外源基因导入的载体. 目前，直接的神经前体细胞移植治疗存在细胞存活有限与宿主细胞的功能整合不佳等问题［4］. 我们通过IκBα突变型基因下调INPCs中NFκB的活性，提高了INPCs缺氧缺糖处理6 h及9 h后的存活率，改善了INPCs对缺氧缺糖的耐受性. 同时缺氧缺糖6 h后乳酸脱氢酶释放量测定，证实转染IκBα突变型基因的INPCs细胞受损程度较轻. 长时间的缺氧缺糖必定会造成细胞不可逆的损伤，着眼于神经前体细胞的移植应用并参考相应文献，我们设定的最长的缺氧缺糖时间为9 h，而更长时间的缺氧缺糖处理对INPCs产生的效应尚需进一步观察.
　　
　　研究［5］证实NFκB可在缺氧复氧模型下的中枢神经系统细胞中激活，而干预NFκB的活性在中枢神经系统缺血缺氧中所引发的效应，有众多不同的研究结果. Duckworth等［6］发现p50基因敲除鼠的大脑中动脉缺血模型中，NFκB的激活减少，神经元的死亡明显较非基因敲除组增多，认为大脑中动脉缺血时，NFκB的激活对神经元起保护作用. 而Jatana等［7］的研究发现，大脑局部缺血时，用5脂氧化酶抑制剂抑制NFκB的激活可起到神经保护作用. Zhang等［8］以特异性启动子启动的IκBα突变型基因为工具，发现大脑中动脉缺血时，抑制NFκB在神经元的激活可减少梗塞容积和神经元的凋亡，而抑制胶质细胞中NFκB的激活无明显作用. 干预NFκB活性所产生的效应有很强的特异性，随干预方式和对象的不同而有所不同，而目前阐明干预NFκB活性对神经前体细胞可能产生影响的研究尚少见报道. 我们的荧光素酶报告基因的检测结果提示，在正常培养状况及缺氧缺糖处理6 h后，转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs中NFκB活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs. 而实验中尚未检测抑制NFκB在INPCs中的活性对下游细胞因子表达的影响. 目前多数研究认为下调NFκB的活性降低了相关炎性细胞因子的表达，从而减少了细胞凋亡.
　　
　　我们体外模拟缺氧缺糖环境，检测了转染IκBα突变型基因及对照载体的INPCs中NFκB的活性、细胞存活及受损情况，证实转染IκBα突变型基因通过降低INPCs中NFκB的活性，提高了INPCs在短期缺氧缺糖处理后的存活率，减轻了细胞损伤. 转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在缺血缺氧环境中有较高的存活率，是进一步用于移植治疗脑缺血等中枢神经系统疾病的良好细胞来源，而存活率提高的机制和细胞移植治疗的具体疗效尚需进一步研究证实.
【

参考文献

】
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　　［3］ Galli R， Gritti A， Bonfanti L， et al. Neural stem cell: An overview［J］. Cire Res，2003，92:598-608.

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　　［5］ 田 晔，万 琪，刘勇红，等. 核因子κB在原代神经细胞缺血再灌注的表达［J］.第四军医大学学报，2003，24（7）：597-599.

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