关于HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用

　　　　　　　　　　作者：陈云茹 刘敏 陈天艳 张树林 陈瑞琳 张曦 石磊

【摘要】 目的：探讨HCVcore与HCBP1的相互作用. 方法：PCR分别扩增含HCV core及HCBP1的cDNA片段，克隆入pGEM T载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM 和pVP16中，并转染入COS7细胞，48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平. 结果：CATELISA检测显示pMcore与pVP16HCBP1实验孔A405 nm值为0.1288，高于其它阴性对照，但低于阳性对照组A值. 结论：哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1有一定的相互作用，可进一步研究HCBP1的细胞功能.
【关键词】 HCV核心蛋白；哺乳双杂交；报告基因
基金项目：国家自然科学基金（30471532）；陕西省科学技术研究发展计划项目（2004K15G1）
　　
　　【Abstract】 AIM: To analyze the interaction between HCV core protein and HCBP1 using mammalian twohybrid assay. METHODS: cDNA fragments encoding HCV core protein and HCBP1 were amplified by PCR and subsequently cloned into pGEM T vector， respectively. After verified by sequencing， they were respectively subcloned into two hybrid plasmids， pM and pVP16. Then， pMcore， pVP16HCBP1 and pG5CAT， a reporter vector， all were cotransfected into COS7 cells. Fortyeight hours later， the interaction between HCV core protein and HCBP1 was assayed by detecting CAT gene expression. RESULTS: CATELISA showed that the A value of the cotransfection experiment group was 0.1288， significantly higher than those of the other negative control groups and lower than that of the positive control group. CONCLUSION: Mammalian twohybrid assay confirms HCBP1 can bind with HCV core protein to some extent. Based on this， we can study the function of HCBP1 further.
　　【Keywords】 hepatitis C virus core protein；mammalian twohybrid assay； reporter gene
　　0 引言
　　
　　丙型肝炎病毒（HCV）核心区位于HCV基因组的342～914nt，其编码的核心蛋白 (core protein) 由191个氨基酸组成，是最保守的HCV蛋白. 核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］. 临床和实验研究显示核心蛋白具有广泛的反式激活作用，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因［2-3］. 我们以往应用酵母双杂交系统［4］，以HCV核心蛋白为诱饵蛋白，在肝文库中筛选到HCV核心蛋白的相互作用蛋白，并命名为HCBP1(GenBank: AF359506)，其主要功能目前尚不清楚.为了研究HCBP1的作用，我们应用哺乳动物双杂交系统以证实HCV核心蛋白与HCBP1的相互作用，为研究HCBP1的功能奠定基础.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 Mammalian MATCHMAKER TwoHybrid Assay Kit（美国Clontech公司）；CAT ELISA Kit（瑞士Roche公司）；克隆有HCV 核心蛋白cDNA的质粒pGBKT7HCV core本室保存; 肝cDNA文库本室保存；PCR Taq酶（美国Promega公司），DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（大连宝生物公司）；DNA凝胶回收试剂盒Lipofectamine2000（Invitrogen公司），测序由上海生工生物工程有限公司完成. COS7细胞（中国科学院细胞库）; PureYield TMPlasmid Midiprep System（美国Promega公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 PCR扩增 克隆编码核心蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCTC3′； 下游引物P2：5′GAATTCGGCTGAAGCGGGCACAGTC3′；以质粒pGBKT7HCV core为模板，PCR反应条件为：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环. 克隆编码HCBP1蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGTGCTCACTGCCTGTGCCCCG3′；下游引物P2：5′GGATCCGGAAGCTGGGCTCGGGGCAG3′；以肝cDNA文库为模板，PCR反应条件为：94℃ 60 s，63℃ 60 s，72℃ 60 s，共30个循环.
　　1.2.2 PCR产物的克隆及鉴定 回收的PCR产物与pGEM T 载体相连，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选. 用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定后将含插入片段的阳性克隆分别命名为pGEM Tcore及pGEM THCBP1，进行序列分析.
　　1.2.3 表达载体的构建及鉴定 用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pGEM Tcore和表达载体pM，pGEM THCBP1和pVP16，回收core protein，pM，HCBP1及pVP16，载体与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α，经限制性内切酶和PCR分析，含正确插入片段的克隆分别命名为pMcore和pVP16HCBP1，并用质粒提取试剂盒进行大规模的质粒提取和纯化.
　　1.2.4 转染COS7细胞 于转染前1日将细胞用胰酶消化，计数并铺板，使转染当日细胞融合度为90%～95%. 在铺板和转染期间避免使用抗生素. 对每个转染样本进行如下操作：① 在500 μL无血清的培养基中稀释以下三种质粒共8.8 μg，使pMcore质粒∶pVP16HCBP1∶CAT质粒比例为5∶5∶1; ② 在每孔中，用500 μL无血清培养基稀释22 μL阳离子脂质体试剂，室温孵育5～10 min; ③ 将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，室温保温20 min; ④ 用1 mL无血清培养基在转染前清洗细胞; ⑤ 将质粒DNA与脂质体试剂的混合物加入细胞，37℃ 50 mL/L CO2保温6 h; ⑥ 6 h后弃去复合物，加入新鲜的完全培养基至正常体积; ⑦ 转染48 h后，弃去细胞培养液，用5 mL冰预冷的PBS洗细胞3遍，最后小心弃去PBS; ⑧ 加1 mL lysis buffer，室温30 min; ⑨ 将细胞溶解后置于1.5EP中，4℃，离心10 min; ⑩ 吸取上清于-70℃迅速冷冻待检. 实验同时设立阴性和阳性对照组.
　　1.2.5 报告基因表达的检测 按CAT ELISA Kit说明操作. ① 标准孔：每孔加入0，1.0， 0.5， 0.25，0.125 mg/L CAT酶标准稀释液200 μL， 实验孔：每孔加入细胞提取液200 μL，37℃，1 h; ② 弃去液体，漂洗液250 μL×30 s×5次，弃去漂洗液; ③ 每孔加入抗CATDIG液200 μL，37℃，1 h; ④ 弃去液体，漂洗液250 μL×30 s×5次，弃去漂洗液; ⑤ 每孔加入抗CATDIGPOD液200 μL，37℃ 1 h; ⑥ 弃去液体，漂洗液250 μL×30 s×5次，弃去漂洗液; ⑦ 每孔加入POD底物200 μL; ⑧ 在酶标仪上测定各孔A405 nm值，以空白孔调零.
　　
　　统计学处理：所有数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析. 计量资料以x±s表示，采用LSDt检验. P＜0.05为差异具有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 核心蛋白及HCBP1基因片段编码区的扩增 扩增出与预期大小一致的cDNA片段（图1，2）. 核心蛋白大小为573 bp，HCBP1大小为959 bp.
　　1：HCV core cDNA; 2：阴性对照; M：DNA marker.
　　图1 HCV core基因片段编码区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
　　1：HCBP1 cDNA; M：DNA marker.
　　图2 HCBP1基因片段编码区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
　　2.2 重组pGEM Tcore质粒及pGEM THCBP1质粒的序列分析 将鉴定正确的pGEM Tcore质粒及pGEM THCBP1质粒分别作正反方向的测序，表明所扩增的核心蛋白和HCBP1基因序列与Genbank中的HCV 核心蛋白和HCBP1序列完全一致（图3，4）.
　　图3 HCV core PCR产物的测序结果与HCV core基因序列的比对（略）
　　2.3 重组pMcore及pVP16HCBP1质粒的酶切分析 用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切下的片段与扩增片段大小一致（图5，6）.
　　图4 HCBP1 PCR产物的测序结果与HCBP1基因序列的比对（略）

转贴于 　　1～3： HCV core cDNA片段; M：DNA marker.
　　图5 重组pMcore质粒的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定（略）
　　1～2： HCBP1 cDNA片段; M：DNA marker.
　　图6 重组pVP16HCBP1质粒的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定（略）
　　2.4 CAT报告基因的检测处理 pMcore及pVP16HCBP1共转染孔呈淡蓝色，阴性对照孔无成色反应，阳性对照孔呈现蓝色反应. 各孔吸光度A值见表1. CATELISA检测结果显示pMcore与pVP16HCBP1实验孔A405 nm值为0.1288，高于其它阴性对照组，表明在哺乳细胞中HCV 核心蛋白与HCBP1可发生一定的相互作用.
　　表1 质粒共转染各组A值（略）
　　aP&<0.05 vs未转染、背景对照、阴性对照.
　　3 讨论
　　
　　大量研究表明，HCV核心蛋白是一个具有多种生物学功能的病毒蛋白，除了作为核壳蛋白参与组装病毒颗粒外，还可以调控细胞、病毒的基因表达及细胞周期和免疫功能. 国内外学者通过病例对照研究，体外细胞培养及转基因鼠模型的研究发现，HCV核心蛋白能够抑制细胞凋亡的启动［5-6］，但也有研究表明，在不同的细胞系中，HCV核心蛋白能增强被感染细胞凋亡的敏感性. 核心蛋白作为一种反式激活蛋白，不仅可以激活人类cmyc基因，IL2和SV40早期启动子活性，也能够抑制T细胞增殖和IFNγ的产生，阻碍机体对HCV感染肝细胞的清除，促使HCV感染慢性化及HCC的发生［7］.
　　
　　HCBP1基因是我们通过酵母双杂交系统筛选出的与HCV核心蛋白相互作用的新蛋白，其全长959 bp，编码319个氨基酸，Mr约为35 ku，其中非极性疏水性氨基酸114个，极性中性氨基酸83个，通过生物信息学工具BLAST进行检索，发现HCBP1与氨基酰化酶Ⅲ（ACY3）的基因序列具有高度同源性. 目前的研究显示，ACY3在乙酰化氨基酸的去乙酰基过程中具有重要作用［8］，而乙酰化是一种重要的基因表达调控方式，组氨酸的乙酰化和去乙酰化紊乱可能引起转录抑制，基因表达异常，从而诱发肿瘤的发生. 研究还发现去乙酰化酶抑制剂可通过改变p21， p53等基因的乙酰化程度来改变基因的表达［9］，进而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡. p53基因可以通过促进p21基因的表达抑制肿瘤细胞的生长，它的活性与它的乙酰化状态有密切的关系. 由此我们推测，与ACY3有很高同源性的HCBP1，可能也参与了乙酰化氨基酸的去乙酰基过程. 本次的哺乳细胞双杂交实验再次证实了HCV core蛋白与HCBP1两者的相互作用. 通过研究HCBP1的细胞功能，可能为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路.

参考文献

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　　［4］ 刘 敏，张 伟，陈天艳，等.HCV 核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测.第四军医大学学报， 2006，27（3）：241-244.

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