关于HPLCFLD法测定丹参素在家兔组织中的分布

　　　　　　　　 作者：胡珊珊 刘洁 刘少静 房敏峰 王世祥 孙文基 郑晓晖

【摘要】 目的：建立高效液相色谱荧光检测（HPLCFLD）分析方法，测定丹参素在家兔心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中的含量. 方法：家兔经丹参药材水提液灌胃后，其重要脏器的匀浆液以100 mL/L高氯酸沉淀，上清液乙酸乙酯萃取. 以4羟基苯甲酸为内标，测定丹参中丹参素在组织中的含量. 结果：HPLCFLD法的检测限为0.01 μg/mL，线性范围为0.05～200.00 μg/mL；丹参中丹参素在家兔心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的含量顺序为c肾&>c肝&>c心&>c肺&>c脑&>c脾. 结论：建立的HPLCFLD检测法具有特异性强，灵敏度高和定量准确等特点，可为其他样品中丹参素的测定提供参考.
【关键词】 丹参素；高效液相色谱荧光检测法；组织分布
　　【Abstract】 AIM: To detection of danshensu levels in rabbit tissues， one of the bioactive compounds in Salvia miltiorrhizae by high performance liquid chromatographyfluorescence detection method (HPLCFLD). METHODS: Tissue samples of rabbits were pretreated by perchloric (100 mL/L) acid after oral administration of Salvia miltiorrhizae. The resulting supernatant was extracted by acetic ether， and the tissue distribution of Danshensu was determined with 4hydroxybenzoic acid used as internal standard. RESULTS: The detection limit of the method was 0.01 μg/mL， and the linear range was 0.05-200.00 μg/mL. The characteristic profile of Danshensu in different tissues was ckidney&>cliver&>cheart&>clung&>cbrain&>cspleen. CONCLUSION: This method is specific， sensitive and accurate， so it could be used for analysis of Danshensu in other biological samples.
　　【Keywords】 Danshensu; HPLCFLD; tissue distribution
　　0 引言
　　
　　丹参具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效［1］，其主要的药理活性成分是丹参素. 目前对于丹参药材及其制剂中丹参素含量的测定多采用高效液相色谱紫外检测法［2-4］（high performance liquid chromatographyuleraviolet detection， HPLCUV）. 然而，HPLCUV法与荧光检测法相比较，存在灵敏度低和特异性较差等缺点，虽然质谱法可用于生物样品中丹参素的分析，但由于该仪器设备比较昂贵而不易被利用和普及. 本研究建立高效液相色谱荧光检测（high performance liquid chromatographyfluorescence detection， HPLCFLD）法，用HPLCUV和HPLCFLD两种方法测定家兔灌服丹参水提物后，其主要脏器组织中丹参素的含量，为丹参药材中丹参素在其他生物体液中的含量测定提供方法.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 健康家兔12只，雌雄兼用，体质量1.8～2.5 kg（动物合格证号：医动字08018，西安交通大学医学院实验动物中心）；1100型高效液相色谱仪（配有荧光检测器，紫外全波长扫描二极管阵列检测器，美国安捷伦公司）；BP221s型电子天平（德国赛多利斯公司）；TGL16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；丹参药材（经陕西省药品检定所鉴定，西安药材公司）. 对照品：丹参素(批号110855200504，中国药品生物制品检定所)；4羟基苯甲酸（化学纯，批号920728，北京化工厂）. 甲醇(色谱纯，美国费希尔公司)；高氯酸、乙酸乙酯、甲酸（均为分析纯，天津化学试剂二厂）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 丹参药材供试品溶液的制备 取丹参药材粉碎干燥至恒重. 精密称取丹参150 g，以8倍量水浸泡30 min，加热回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，抽滤，滤液减压浓缩至75 mL，4℃冷藏备用.
　　1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参素对照品5.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制备成0.50 mg/mL的丹参素对照品溶液. 同法制备0.91 mg/mL的4羟基苯甲酸供试品溶液（内标溶液）.
　　1.2.3 含药组织供试品溶液的制备 随机抽取健康家兔6只，按10 g/kg丹参生药量灌胃，于给药后50 min处死，迅速摘取心、肝、脾、肺、肾、脑，液氮冷冻. 解冻后，分别精密称取脾0.8 g，心2.0 g，肝、肺、肾和脑均为4.0 g，于脾中加入1.2 mL生理盐水，于心中加入3.0 mL生理盐水，于肝、肺、肾和脑中各加入6.0 mL生理盐水，冰浴下匀浆. 匀浆液于2146.56 g离心10 min，取上清液，以0.5 mL匀浆液加50.0 μL 浓度为100 mL/L高氯酸沉淀蛋白，于2146.56 g离心10 min，取上清液，上清液用2倍量（V∶V）乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干， 残渣用0.5 mL流动相溶解， 0.45 μm微孔有机系膜滤过， 4℃冷藏备用.
　　1.2.4 色谱条件 色谱柱：安捷伦ZORBAX SBC18液相色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶水（含2 mL/L甲酸）=(92∶8)；荧光检测器激发波长278 nm，发射波长320 nm；紫外全波长扫描二极管阵列检测器检测波长：280 nm；柱温：25℃；流速：0.8 mL/min.
　　1.2.5 标准曲线制备 随机抽取健康家兔6只，断颈处死后，按1.2.3的方法制备混合空白组织供试品溶液，取6份混合空白组织供试品溶液1.0 mL，分别加入适量丹参素对照品溶液，制备一系列浓度对照品溶液. 在拟定色谱条件下，进样20.0 μL，分别记录丹参素与内标物峰面积.
　　1.2.6 精密度和方法回收率 取空白组织样品混合溶液各三份，分别加入适量的丹参素对照品溶液和20.0 μL内标溶液，制备0.50，50.00和200.00 μg/mL低、中、高三个浓度的丹参素组织样品溶液，在拟定色谱条件下分析测定，以各浓度分别在同日测定6次的峰面积，计算日内精密度相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）值. 再按以上测定方法每日测定1次，连续6 d重复测定，记录峰面积，计算日间精密度RSD值. 以丹参素测得量与加入量之比计算方法回收率.
　　1.2.7 稳定性试验 将1.2.6的方法制备的0.50，50.00和200.00 μg/mL低、中、高三个浓度的丹参素组织样品溶液，分别置于-20 ℃冰冻24 h后自然解冻，重复6次，在拟定分析条件下测定其冻融稳定性.
　　
　　统计学处理： 实验结果以x±s表示， 用SPSS 11.0进行数据处理，同一脏器两种检测结果的分析采用t检验法，同一方法不同脏器测定结果的分析采用方差分析，采用直线相关与回归分析法确定标准回归方程. 显著性检验水平设为α=0.05.
　　2 结果
　　2.1 色谱行为及专属性 以肾脏样品为例，在拟定色谱条件下，与空白肾脏相对比，含药肾脏中丹参素得到较好的分离（图1，2）. 其它组织样品中丹参素在同一色谱条件下亦得到较好分离.
　　A：空白肾脏；B：含药肾脏. 峰1：丹参素；峰2：4羟基苯甲酸.

　　图1 肾脏供试品溶液紫外色谱图（略）
　　A：空白肾脏；B：含药肾脏. 峰1：丹参素；峰2：4羟基苯甲酸.
　　图2 肾脏供试品溶液荧光色谱图（略）
　　2.2 线性关系 以丹参素与内标物峰面积的比值对丹参素的浓度进行线性回归，得HPLCUV法的丹参素回归方程y=2.8586x+0.3970， r=0.9997 （n=6）， 线性范围0.50～200.00 μg/mL， 最低检测限0.50 μg/mL（S/N=3）；HPLCFLD法的丹参素回归方程y=15.0302x+1.6758， r=0.9996 （n=6），线性范围0.05～200.00 μg/mL，最低检测限0.01 μg/mL（S/N=3）.
　　2.3 精密度和方法回收率 在0.50，50.00和200.00 μg/mL三个浓度下，FLD法日内精密度RSD值分别为4.33%，2.60%和1.76%；日间精密度RSD值分别为4.71%，3.12%和1.34%. 低、中、高三个浓度的方法回收率分别为(102.81±2.68)%， (92.50±1.95)%和(93.61±2.31)%，证明该方法符合美国食品药品管理局（Food and Drug Administration， FDA）对生物样品的测定要求.
　　2.4 稳定性 以冻融后与冻融前的样品浓度百分比计算0.50，50.00和200.00 μg/mL低、中、高三个浓度样品溶液的稳定性，结果分别为(95.83±2.26)%，(101.20±3.21)%和(99.61±3.64)%.
　　2.5 组织分布 精密吸取丹参含药组织供试品溶液20.0 μL，在拟定色谱条件下，测定不同脏器中丹参素含量. 两种检测方法对同一脏器的测定结果无统计学差异，同一检测方法在不同脏器间测定结果差异有统计学意义(P&<0.05，表1).
　　表1 各脏器组织中丹参素分布含量（略）
　　aP&<0.05 vs其他脏器， bP&<0.05 vs其他脏器， cP&<0.05 vs其他脏器， dP&<0.05 vs其他脏器， eP&<0.05 vs其他脏器， fP&<0.05 vs其他脏器.
　　3 讨论
　　
　　本研究建立HPLCFLD法测定家兔组织中丹参素的含量，组织样品杂质干扰较少，可有效排除组织样品中与丹参素吸收相近的物质，具有特异性强、灵敏度高等优点，可满足丹参素在生物样品中的测定［5］.
　　
　　在蛋白沉淀剂的选择过程中，本实验对丙酮、100 mL/L高氯酸和100 mL/L三氯乙酸进行了考察. 结果表明，用丙酮处理的样品干扰较大，而用高氯酸和三氯乙酸处理的样品无干扰，但采用高氯酸处理样品的回收率明显高于用三氯乙酸处理的样品，故最终选择100 mL/L高氯酸为蛋白沉淀剂.
　　
　　UV法和FLD法测得丹参素在家兔心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中的分布特征均为c肾&>c肝&> c心&>c肺&>c脑&>c脾. 然而，FLD法与UV法测定结果无显著性差异. 另一方面，同一方法不同组织间测定结果差异有统计学意义，且以心、肝和肾中的浓度相对较高，为丹参归心、肝经的理论论述提供了依据. 而丹参素在肾中浓度最高，其原因可能是丹参素的排泄方式以肾排泄为主有关.

参考文献

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