关于pEGFPN1linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MHCC9

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　　　　　　　　　　作者：马俊 陈明浩 窦科峰 李军 郑伟 霍斌亮 张福琴 李海民

【摘要】 目的：构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体，并导入人肝癌细胞MHCC97中表达. 方法：提取木薯总RNA，PCR扩增lis目的基因，将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFPN1上，构建重组质粒载体. 利用电穿孔转染体外培养的MHCC97，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lisEGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达; Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达. 结果：PCR扩增片段与预期结果相符， 酶切和测序证明pEGFPN1lis真核表达载体构建成功. pEGFPN1lis转染MHCC97细胞后，Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达，用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达. 结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1lis，可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.
【关键词】 木薯亚麻苦甙水解酶；聚合酶链反应；基因转染；自杀基因
　　【Abstract】 AIM: To construct pEGFPN1linamarase eukaryotic expression vector using green fluorescence protein as reportor gene and transfect MHCC97 cells with it. METHODS: The cassava tissue linamarase (lis) genes were amplified with PCR technique and inserted into pEGFPN1 vector. The MHCC97 cells were transfected with the formed plasmid by means of electrotransfer. The lisEGFP fused protein was visualized directly with fluorescence microscope， and the expression of linamarase was detected by Western Blot and PCR. RESULTS: The restriction enzyme digestion and sequence analysis showed that recombined cloning vector pEGFPN1lis had been constructed successfully， which was expressed in eukaryotic cells stably. Lis gene and protein were detected in the transfected MHCC97 cells， meanwhile the expressed EGFP was observed under fluorescence microscope. CONCLUSION: Constructing the expression vector pEGFPN1lis successfully， it provides a good basis for further research on gene therapy for tumour.
　　【Keywords】 linamarase；PCR；gene transfer techniques；suicide gene
　　0 引言
　　
　　近年来，自杀基因已经成为新的肿瘤治疗手段［1］，但由于已有的自杀基因系统存在着杀伤效率低等问题，因此，提高自杀基因的杀伤效率及旁观者效应已成为现阶段的研究热点. 有研究［2-5］表明，源自木薯的新型自杀基因系统亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（linamarase/linamarin，lis/lin）对肿瘤细胞具有杀伤作用，能够有效的杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长，但有关lis/lin系统的功能仍不十分清楚［6］. 本研究拟从木薯中获得lis基因，构建真核表达载体pEGFPN1lis，转染MHCC97细胞，建立稳定表达lis基因的细胞系，并对其在MHCC97细胞中表达加以鉴定，为深入研究lis/lin自杀基因系统功能提供依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 pEGFPN1质粒由西京医院肝胆外科李韧博士惠赠. 限制性内切酶、DNA连接酶（日本TaKaRa公司）；反转录试剂盒（美国Fermentas公司）；凝胶回收纯化试剂盒（美国Promega公司）；DMED高糖培养基，胎牛血清（美国Gibco公司）；Taq Plus DNA聚合酶，RNAplant试剂盒（北京TIANGEN公司）；蛋白质杂交免疫印记ECL化学发光试剂盒（上海卓康公司）. 大肠杆菌DH5α和MHCC97细胞由西京医院肝胆外科实验室保存.
　　1.2 方法
　　1.2.1 引物设计与合成 根据lis基因的序列设计引物. 上游引物为： 5′ACTCTCGAGATGCTCGTCTTGTTCATAAG3′；下游引物为：3′CGAGTCGACAACATCACATAGAATTTGC5′. 其中分别在上游和下游引物5′端加上Xho I和Sal I酶切位点. DNA测序及引物合成由北京奥科公司完成.
　　1.2.2 lis基因的获取 将新鲜的木薯芽在液氮中研磨破解细胞壁，通过RNAplant试剂盒提取木薯总RNA，所得RNA加入适量的无酶水溶解备用. 按反转录试剂盒说明将提取的RNA转录为cDNA. 采用PCR方式扩增lis基因，25 μL反应体系为：3.0 μL上游及下游引物，2 μL cDNA模板，12.5 μL Taq Plus MasterMix，7.5 μL无酶水. PCR反应条件：94℃ 30 s，62.5℃ 1 min，72℃ 2 min，共35个循环；72℃延伸10 min. 反应结束后10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析.
　　1.2.3 lis重组真核表达载体的构建 将PCR产物和提纯的pEGFPN1质粒分别经Xho I和Sal I双酶切，酶切产物经10 g/L琼脂糖电泳后回收. 在T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态菌，卡那霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后命名为pEGFPN1lis.
　　1.2.4 建立稳定转染lis基因的MHCC97细胞系 消化法收集3×106个处于对数生长期MHCC97细胞，分别同20 μg pEGFPN1lis质粒和20 μg pEGFPN1质粒混匀，置于400 μL的穿孔杯中，800 V，5 ms电穿转染，转染后接种于24孔板中. 转染24 h后，改用含有G418选择性培基（600 mg/L）中加压筛选约4 wk，获得具有卡那霉素抗性的阳性细胞克隆. 有限稀释法扩增培养获得稳定表达lis基因和EGFP基因的MHCC97细胞系， 分别命名为MHCC97lis细胞和MHCC97EGFP， 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.
　　1.2.5 PCR检测lis基因转录水平的表达 收集MHCC97EGFP细胞和MHCC97lis细胞，按Trizol试剂说明书操作方法提取细胞总RNA. 将总RNA反转录成cDNA第一链，随后对lis基因进行PCR扩增. PCR扩增条件为: 94℃ 30 s，62.5℃ 1 min，72℃ 2 min，共34个循环；72℃延伸10 min. 取等体积PCR产物进行10 g/L凝胶电泳分析结果.
　　1.2.6 Western Blot检测lis基因翻译水平的表达 收集MHCC97EGFP细胞和MHCC97lis细胞，裂解后取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳(50 g/L浓缩胶，电压80 V，30 min；100 g/L分离胶，恒压100 V，2.5 h)，半干式电转膜槽将PAGE转至硝纤膜上(恒流80 mA，3 h)，置于50 g/L的脱脂牛奶的TBST/1 g/L TweenPBS 4℃过夜， 1 g/L TweenPBS洗膜3×10 min，边洗边摇. 相应的二抗37℃室温30 min， PBST洗膜3×10 min，边洗边摇. 免疫印记ECL化学发光试剂盒检测蛋白.
　　1.2.7 荧光检测lis蛋白在细胞中的定位 在细胞转染pEGFPN1lis后24 h，在荧光显微镜下观察转染效果. 收集MHCC97lis细胞在荧光显微镜下观察重组质粒的在MHCC97细胞中的定位情况，激光共聚焦显微镜观察拍照.
　　2 结果
　　2.1 lis基因的获取 以提取的木薯RNA反转录得到的cDNA为模板，利用lis特异性的引物进行PCR扩增，得到预期约1600 bp的条带，条带清晰，无特异性扩增现象（图1）.
　　M: DNA marker（DGL4000）；1: linamarase.
　　图1 lis基因PCR扩增结果（略）
　　2.2 真核表达载体pEGFPN1lis的鉴定 双酶切鉴定结果显示， 重组质粒pEGFPN1lis经Xho I和Sal I双酶切后得到一条约为1600 bp的目的条带和一条约为4.7 ku空载体条带. 而pEGFPN1空载体经双酶切后只得到一条约4.7 ku空载体条带. 重组质粒pEGFPN1lis分别经Xho I和Sal I单酶切后得到一条约6 ku条带. 对重组质粒pEGFPN1lis进行DNA序列测定， 重组质粒插入片断的序列与lis基因序列完全一致，证明lis基因的真核表达载体构建成功(图2).
　　M: DGL4000；1: pEGFPN1lis+XhoI+SalI；2: pEGFPN1lis+XhoI；3: pEGFPN1lis+SalI；4: pEGFPN1.
　　图2 pEGFPN1lis质粒双酶切鉴定结果（略）
　　2.3 细胞克隆中Lis基因RNA表达 细胞总RNA中lis基因的mRNA水平的PCR分析表明， MHCC97lis细胞所提RNA能够扩增出代表lis基因的条带. 而MHCC97EGFP所提RNA不能扩增出代表lis基因的条带.说明lis基因在稳定转染pEGFPN1lis的MHCC97细胞中mRNA水平上得到表达(图3).
　　1: MHCC97lis细胞; 2: pEGFPN1转染细胞； M：DGL4000.
　　图3 稳定转染pEGFPN1lis细胞的PCR 分析结果（略）

　　2.4 细胞克隆中lis蛋白的表达 Western Blot分析结果表明，MHCC97lis的细胞中检测到lis蛋白的条带，而对照组转染MHCC97EGFP细胞则无相应的条带(图4).
　　1：MHCC97lis细胞；2：pEGFPN1转染MHCC97细胞.
　　图4 稳定转染pEGFPN1lis细胞的Western Blot分析结果（略）
　　2.5 转染的MHCC97中荧光蛋白表达观察 在荧光显微镜下，重组质粒pEGFPN1lis转染MHCC97细胞24 h后已有绿色荧光蛋白的表达，显微镜下可清楚看到细胞发出绿色荧光(图5A)，证明pEGFPN1lis已经转染成功. G418筛选4 wk后，未转染的MHCC97细胞已被G418杀死，MHCC97lis细胞具有抗性，经过有限稀释法扩增培养后可见大量绿色荧光蛋白的表达(图5B).
　　A: 转染24 h后 ×200； B: 转染4 wk后 ×100.
　　图5 稳定转染pEGFPN1lis细胞的荧光检测（略）
　　
　　3 讨论
　　
　　近年来研究［7-9］发现lis基因编码一种β葡萄糖苷酶，它可以水解无毒的底物lin，生成丙酮氰醇和葡萄糖. 丙酮氰醇在pH值大于6时不稳定，可自发分解成丙酮和氰化物HCN，HCN对细胞有强烈的毒性，能够杀伤细胞. Corte等［10］将lis基因及其前体药物亚麻苦苷用于脑胶质细胞瘤的治疗，发现该系统对肿瘤细胞有很强杀伤作用， 将基因克隆到真核表达载体中，把该基因转入到的宿主细胞，从而观察宿主细胞的变化是研究基因功能的一种有效方法［1，11］. 本试验所选用的载体pEGFPN1不仅具有CMV的启动子，而且携带有绿色荧光蛋白. 我们所构建的真核表达载体pEGFPN1lis中，由于有CMV的启动子的调控，可以增强lis基因的表达，同时绿色荧光蛋白的表达能够清楚的显示真核载体的转染情况以及lis基因的表达. pEGFPN1lis重组质粒表达的融合蛋白既具有lis蛋白的活性又具有EGFP蛋白的活性，而且对细胞没有毒性作用，不损伤细胞. 另外，转染细胞后观察更加方便. 本研究结果还预示了lis/lin自杀基因系统用于肝癌是一种可行的基因治疗策略.
　　
　　综上所述，我们运用基因工程方法成功构建了pEGFPN1lis真核表达载体，通过电穿孔法转染及G418筛选建立了稳定表达lis基因的MHCC97细胞株，为研究lis基因的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了实验基础，也为进一步研究创造了条件.
【

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