关于小鼠结肠癌CT26细胞PARP抑制后肝转移变化的影响

【摘要】 目的:探讨小鼠大肠癌CT26细胞聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔Poly(ADPribose)polymerase，PARP〕抑制后肝转移变化及其可能的机制. 方法： 采用小鼠结肠癌CT26细胞肝转移模型，5氨基异喹啉酮(5AIQ)为PARP抑制剂. 实验组分为两组，分别腹腔注射5AIQ 3 mg/（kg·d）和5AIQ 10 mg/（kg·d），对照组给予相应体积双蒸水. 14 d后，观察各组小鼠脾脏原发肿瘤和肝脏转移肿瘤体积、数目的变化. Western Blot检测PARP，NFκB，基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）蛋白在各组脾脏原发瘤组织中的表达. 结果： 5AIQ 3 mg/（kg·d）浓度组和5AIQ 10 mg/（kg·d）浓度组脾脏肿瘤体积分别为（0.92±0.23）cm3和（0.88±0.43）cm3，与对照组（2.64±0.72）cm3相比较明显缩小，差异具有统计学意义(P&<0.05)；肝脏转移结节数目5AIQ 3 mg/（kg·d）浓度组和5AIQ 10 mg/（kg·d）浓度组分别为(4.20±2.95)个，(5. 40±3.31)个，两组间差异无统计学意义（P&>0.05），但与对照组(47.18±9.81)个相比较，差异均具有统计学意义（P&<0.05）. 5AIQ 3 mg/（kg·d）浓度组小鼠脾脏原发瘤组织PARP，NFκB，MMP2和MMP9表达分别为（1.00±0.09），（0.55±0.03），（0.58±0.05），（0.48±0.06），与对照组（1.56±0.14），（0.84±0.07），（0.91±0.08）和（0.74±0.10）相比较明显降低，差异具统计学意义（P&<0.05）. 结论： 小鼠结肠癌CT26细胞PARP抑制可抑制肿瘤的生长及肝转移，可能与PARP通过NFκB调节MMP2，MMP9蛋白表达有关.
【关键词】 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶; NFκB；肝转移;结肠肿瘤
　　 0引言
　　聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔Poly(ADPribose) polymerase，PARP〕是一种普遍存在于真核细胞内的单体核酶，研究［1-3］发现其与多种疾病有关. 抑制PARP可抑制炎症过程中内皮细胞NFκB依赖性基因（如Pselectin，ICAM1）的表达，并可抑制新生血管的形成［4］. 但抑制PARP能否达到抑制大肠癌细胞的生长和转移的相关研究还少见报道. 本研究应用小鼠结肠癌CT26细胞肝转移模型，观察体内PARP抑制剂5氨基异喹啉酮(5aminoisoquinolinone，5AIQ) 腹腔注射给药抑制小鼠大肠癌CT26细胞PARP后，脾脏原发瘤生长和肝转移变化，检测PARP，NFκB，MMP2和MMP9在小鼠脾脏原发瘤组织中的表达，初步探讨小鼠体内PARP抑制与肿瘤生长及转移的关系及其可能的机制.
　　1材料和方法
　　1．1 材料雌性BALB/c小鼠18只，6～8 wk龄，体质量17～23 g(重庆医科大学实验动物中心)；小鼠结肠腺癌细胞CT26，由四川大学魏于全教授惠赠；5AIQ，由英国Bath大学Threadgill教授惠赠；抗PARP，NFκB， MMP2，MMP9和βactin抗体，增强化学发光法试剂盒（美国Santa Cruz公司）； HRP标记的兔抗羊IgG抗体（北京中杉生物技术公司）；HRP标记的羊抗兔IgG抗体，蛋白印迹免疫沉淀组织细胞裂解液（北京博奥森公司）；核蛋白裂解液（美国pierce公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1实验分组与模型建立参照文献［5］的方法， 对18只BALB/c小鼠进行CT26细胞脾包膜下接种，并随机分为两个5AIQ不同浓度实验组和一个对照组. 实验组小鼠分别腹腔注射 5AIQ 3 mg/（kg·d）和5AIQ 10 mg/（kg·d）；对照组小鼠腹腔注射相应体积的双蒸水. 14 d后处死各组小鼠，观察其脾脏肿瘤体积大小、数目和肝脏肿瘤转移结节数目、大小、有无融合等. 光镜下观察脾脏肿瘤和肝转移灶组织学变化. 取脾脏肿瘤组织，液氮保存备用. 参照文献［6］的方法，按下列公式计算脾脏肿瘤体积（V）：V=0.5×a×b2. 其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径，若有多个肿瘤则计算体积的总和.
　　1.2.2Western Blot检测
　　1.2.2.1PARP，NFκB蛋白表达 将保存于液氮中5AIQ 3 mg/（kg·d）组及对照组脾脏肿瘤组织，裂解、匀浆. 按核蛋白裂解液说明提取核蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度. 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，将蛋白质转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入抗PARP，NFκB抗体一抗，4℃ 过夜，分别加入相应的辣根过氧化物酶标记的IgGⅡ抗，室温孵育1 h，采用ECL试剂盒进行化学发光显影. 凝胶成像仪照相，目的条带用图像分析软件(Quantity One)进行吸光度值分析. 以βactin为内对照，PARP，NFκB与βActin A的比值作为蛋白表达含量.
　　1.2.2.2MMP2，MMP9蛋白表达将保存于液氮中5AIQ 3 mg/（kg·d）组及对照组脾脏肿瘤组织，裂解、匀浆. 提取总蛋白， 并用BCA法测定蛋白浓度. 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，将蛋白质转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭，加入抗MMP2，MMP9抗体一抗，4℃ 过夜，洗涤后，分别加入相应的辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，其余步骤同1.2.2.1.
　　统计学处理：实验数据以x±s表示，采用SAS8.0统计软件，进行Krukalwallis秩和检验和Nemenyi法分析，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1CT26细胞脾原发瘤和肝转移灶组织学观察光镜下观察，脾脏见明显的低分化腺癌组织，肿瘤细胞异型性明显，形成癌巢，肝脏内亦可见转移性低分化腺癌，结构与脾脏内肿瘤形态结构相似（图1）. 其他器官未见肿瘤转移结节形成.
　　A：脾脏低分化腺癌； B:肝脏低分化腺癌.
　　图1小鼠脾原发瘤和肝转移灶组织学变化HE ×400
　　2.2PARP抑制剂 5AIQ对小鼠结肠癌CT26细胞肝脏转移的影响5AIQ 3 mg/（kg·d）浓度组和10 mg/（kg·d）浓度组，脾脏均可见肿瘤结节，多为1～3个，其脾脏肿瘤体积分别为（0. 92±0.23）cm3和（0.88±0.43）cm3，与对照组（2.64±0.72）cm3相比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)；但5AIQ不同剂量浓度组之间差异无统计学意义(P&>0.05). 5AIQ 3 mg（kg·d）浓度组和10 mg/（kg·d）浓度组肝脏转移结节数分别为(4.20±2.95)个，(5.40±3.31)个，较对照组(47.18±9.81)个减少，差异具有统计学意义(P&<0.05)；但5AIQ不同剂量浓度组之间的差异无统计学意义(P&>0.05，图2).
　　1：对照组； 2：5AIQ 3 mg/(kg·d）组.
　　图25AIQ处理前后脾脏肿瘤PARP，NFκB，MMP2，MMP9的表达
　　2.3脾脏肿瘤组织PARP，NFκB， MMP2，MMP9蛋白表达经Western Blot分析， 5AIQ 3 mg/(kg·d)浓度组小鼠脾脏肿瘤组织中PARP，NFκB， MMP2H，MMP9蛋白表达明显弱于对照组小鼠脾脏肿瘤组织（图2）. 经统计学Krukalwallis秩和检验方法分析，差异均具有统计学意义(P&<0.05，表1）. 表1小鼠脾脏肿瘤各蛋白表达
　　3讨论
　　PARP是一种广泛存在于真核细胞核内的核酶，在肿瘤研究中，仅有不同肿瘤组织（如肝癌、前列腺癌［2］等）PARP表达增加的报道. 而我们前期研究［3，7］则观察到人大肠癌伴转移者PARP表达较不伴转移者增加， PARP抑制剂5AIQ可抑制小鼠结肠癌CT26细胞基质黏附、运动及侵袭能力.
　　本研究以腹腔注射方式，观察了PARP抑制剂5AIQ对大肠癌CT26细胞PARP抑制后，小鼠体内肿瘤生长转移的影响. 结果显示，5AIQ腹腔注射后小鼠CT26细胞 PARP抑制，小鼠体内脾脏原发瘤生长体积减小，且肝脏转移结节形成减少. 提示，小鼠CT26细胞PARP活性抑制，可抑制其生长和转移. 转贴于 有研究［8］报道，在肿瘤转移过程中，MMP2，MMP9具有重要作用，并与NFκB活性有关. 炎症中， PARP抑制引起Pselectin，ICAM1降低，与PI3K/Akt和MAPR信号通路中蛋白激酶（如P38，Akt等）磷酸化状态发生改变，从而降低NFκB的转录活性有关［9-10］. 本研究也同时观察了PARP抑制状态下，CT26细胞NFκB，MMP2，MMP9的表达变化，结果显示，5AIQ 可抑制CT26细胞PARP表达，同时，NFκB，MMP2，MMP9的表达也均相应降低. 提示，CT26细胞PARP抑制，可抑制NFκB活性，从而下调NFκB依赖性基因MMP2，MMP9的表达. 因此我们认为，PARP抑制剂可抑制CT26细胞转移，可能与PARP抑制剂减少了NFκB的活化，降低了MMP2，MMP9的表达有关.
　　此外，离体实验表明，PARP抑制剂5AIQ可抑制结肠癌细胞与血管内皮细胞的黏附［11］，我们推测，小鼠腹腔内注射5AIQ，可能对CT26细胞与血管内皮细胞的黏附也具有抑制作用，从而有利于抑制癌细胞的生长和转移，其分子机制还有待深入研究.

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