关键词: 喉肿瘤;基质金属蛋白酶;免疫组化;淋巴转移
摘 要:目的 研究MMP-2及TIMP-2在喉癌组织中表达的情况及其临床相关性. 方法 用免疫组化LSAB法检测64例石蜡包埋的喉鳞癌组织与5例正常喉粘膜组织石蜡标本中MMP-2和TIMP-2的表达. 结果 在淋巴结转移组与非淋巴结转移组MMP-2的阳性表达率分别为74%和39%，TIMP-2的阳性表达分别为52%和24%，经统计学分析二者的χ2 值分别是7.1800（P&<0.05），5.0420（P&<0.05），表明明显相关.而MMP-2与TIMP-2的阳性表达率与喉癌的部位、分化程度、临床分级、病理分级均无明显相关. 结论 检测MMP-2和TIMP-2的表达对喉鳞癌的诊断和预后有一定的参考价值.
Keywords:laryngeal neoplasms;matrix metalloproteinase;immunohistochemical;lymphatic metastasis
Abstract:AIM To study the expressions of matrix metallo-proteinase-2and tissue inhibitor of metalloproteinase-2in hu-man laryngeal squamous cancer and the relationship between the expressions and clinical features.METHODS MMP-2and TIMP-2were examined with immunohistochemical SAB method in the paraffinembedded specimens from64cases with laryngeal squamous cell carcinoma（LSCC）and5normals who served as the contol.RESULTS In the group of cervical lymphnode involvement and non-cervical lymphn-ode involvement，their positive rates of MMP-2were74%and39%，and their positive rates of TIMP-2were52%and24%，（MMP-2’sχ2 =7.1800，P&<0.05;TIMP-2’sχ2 =5.0420，P&<0.05），which showed a significant correlation between them.MMP-2and TIMP-2had no relationship with the situation and malignant degree.Both MMP-2and TIMP-2were expressed more strongly in carcinoma with cervical lymphnode involvement group than in non-cervical lymphn-ode involvement group，but the high TIMP-2expression could not control the activity of MMP-2.Nonbalance be-tween MMP-2and TIMP-2bore no relationship to human la-ryngeal squamous cell carcinoma invasion and metastasis.CONCLUSION The detection of MMP-2and TIMP-2ex-pressions may contribute to diagnosis and prognosis of LSCC.
0 引言
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）通过对细胞外基质（extracell matrix，ECM）的降解而促进癌细胞对周围组织的浸润;其抑制剂，基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloteinases，TIMPs）则通过下调金属蛋白酶的活性而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移［1，2］ .MMPs及TIMPs在喉鳞癌中表达的研究报道甚少.为了探讨MMPS及TIMPS在喉癌组织中的作用，我们采用免疫组化的方法，检测64例喉鳞状细胞癌组织中MMP-2及TIMP-2的表达情况，分析喉癌在不同的生长部位、不同的临床分期、不同病理分级、是否有淋巴结转移等各种情况下二者的阳性表达率，再经过统计学处理后探讨其临床相关性.
1 材料和方法
1.1 材料 山西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科1997/1999年活检或手术切除的经病理证实为鳞状细胞癌64（男53，女11）例，年龄41～75岁，术前未作过放疗和化疗.声门上型14例，声门型29例，混合型21例.按细胞分化程度分为:I级18例，II级33例，III级13例.经临床及颈清扫术证实有淋巴结转移的23例，无淋巴结转移的41例.按1987年颁布的分级标准，T1 ～T2 级43例，T3 ～T4 期级21例.5例正常喉粘膜取自尸检患者，所有标本均经40g・L-1 甲醛固定，石蜡包埋.所用试剂均由福州迈新公司提供，喉癌组织为石蜡包埋的存档蜡块.
1.2 方法 连续4μm切片，正常喉粘膜标本经石蜡包埋，再作连续4μm切片.石蜡切片脱蜡至水.在30mL・L-1 h3 O2 中浸泡10min，以阻断内源性过氧化物酶活性.PBS洗5min×3.抗原修复:检测MMP-2用40g・L-1 胃蛋白酶消化，37℃条件40min;检测TMP-2为枸橼酸盐热修复10min，90℃～98℃条件.PBS冲洗5min×3.100mL・L-1 的正常山羊血清封闭，37℃孵育10min，倾去血清，滴加1∶100的MMP-2mAb或1∶100的TIMP-2mAb，4℃过夜，PBS冲洗5min×3，滴加1∶100的抗体37℃，孵育30min，PBS冲洗5min×3，滴加1:100的辣根酶标记链霉素卵白素，37℃孵育30min，PBS冲洗5min×3，DAB染色20min，苏木素复染.封片.免疫组化阳性信号显示为棕黄色颗粒，选取5个有代表性不重叠的高倍视野，计算棕黄色颗粒所占的面积百分比，平均面积百分比&<10%为阴性，&>10%为阳性. 统计学处理:采用χ2 检验［3］ .
2 结果
正常喉粘膜组织中末见有MMP-2及TIMP-2表达.在喉癌组织中，MMP-2主要表达于癌巢周边的细胞，癌巢周边的基质，癌周浸润的单核细胞，基质细胞，血管内皮细胞，TIMP-2主要表达于癌巢周边基质及个别癌细胞（Fig1）.
图1 略
表1 喉癌组织中MMP-2和TIMP-2的阳性表达 略
3 讨论
基质金属蛋白酶（MMPs）活性异常有利于肿瘤的浸润和转移［4］ .恶性肿瘤通过附着、基质溶解及移动3个连续重复的过程使基质受到侵袭、破坏.基底膜是由IV型胶原、糖蛋白、蛋白多糖等组成的厚实的网状结构，IV型胶原是其主要支架.MMP-2是MMPs中的一种即明胶酶A，它可降解基底膜中的IV型胶原，从而破坏基底膜，有利于肿瘤的浸润与转移.而基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）则能与活化MMPs的结合抑制其活性，还能以共价健的形式与明胶酶原结合，从而抑制明胶酶的活性及其活化，TIMPs中的TIMP-1和TIMP-2都能与MMP-2呈1∶1结合，且TIMP-2对MMP-2的抑制作用较TIMP-1强7～10倍以上，TIMP-2通过抑制MMP-2的活性抑制ECM的降解，从而抑制肿瘤的局部生长、浸润和转移，阻止继发灶的形成和限制肿瘤血管的形成，因此，肿瘤的浸润和转移与TIMP-2及MMP-2均有关.
MMP-2阳性表达说明癌组织对基底膜产生了降解、破坏并有新生血管的形成，肿瘤的持续生长、浸润和转移依赖于新生血管的形成［5］ ，血管的形成是肿瘤迅速生长和转移的必要条件，其形成可促进肿瘤病灶的三维扩散［6］ .在相应部位TIMP-2表达率也增高，这是由于局部在受到肿瘤的刺激后可以产生更多的TIMP-2.在淋巴结转移组MMP-2，TIMP-2阳性表达率均高于无淋巴结转移组.MMP-2的阳性表达率分别为74%（17/23），39%（16/41）.TIMP-2的阳性表达率分别为52%（12/23），24%（10/41），并有显著的病理学统计意义（P&<0.05）.二者阳性表达率增高与喉癌淋巴转移有关.这是由于TIMP-2增高的程度不足以抑制MMP-2的活性.MMP-2-TIMP-2失衡导致了基底膜的降解和肿瘤血管的形成，进而促进肿瘤的浸润和转移.由此可见MMP-2和TIMP-2是反映肿瘤浸润和转移的指标.
参考文献
［1］Xie YM，Nie QH，Zhou YX，Kang WZ，Zhu XH，Wang YM.TIMP-1and-2related antigens expression in liver carcinoma tis-sues ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fouth Mil Med Univ），2001;22（19）:1787-1790.
［2］Xie YM，NIE QH，Zhou YX，Zhu XH，Wang JP，Duan GR.Tissue inhibitors of metalloproteinase-1and-2（TIMP-1and TIMP-2）related antigens expression in liver tissues of patients with liver cirrhosis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:790-792.
［3］LüCL，Liao BJ，Fan JP.The detection of HPV infection，P16expression in laryngeal squamous cancer and the study of their relationship with clinical cases ［J］.Clin Exp Pathol，1999;15（5）:382-384.
［4］He SY，Xin XY，Wang T.Expression of matrix metallopi-oteinase-2and CD147in ovarian epithelial tumor ［J］.Di-si Jun-yi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（5）:435-438.
［5］Liu DC，Chen BQ，Wang H.Expression and significance of vas-cular endothelical growth factor in bladder transitional cell carci-noma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（11）:1346-1348.
［6］Du P，Wei JG，Li HP，Wang YX，Wu QZ，Huang J.Expres-sion of vascular endothelical growth factor in nude rat liver after planting human hepatocelluar carcinoma cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（12）:1085-1088.转贴于