作者：王春婷，游思维，刘惠玲，陈秉耀，焦西英，孟晓梅，吴宗亮，鞠 躬
【关键词】 脊髓切断术
关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠
摘 要:目的 比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果 A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论 经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术方法.
Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;rat
Abstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODS Thirty-two adult male SD rats were pided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection was verified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap between the2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one of the stumps.The appearance of the exposed spinal cord was ob-served with naked eyes1h after the surgery，and the locomo-tor recovery of the hindlimbs was evaluated with the BBB rat-ing scale at8wk after surgery before sacrificing all animals.The damaged spinal cord segments were sectioned sagittally，prepared for anti-neurofilement immunostaining，and ob-served under a light microscope for any possible remaining and regenerating nerve fibers as well as the formation of cavi-tation and scars.RESULTS Spinal cord edema and ectropi-on could be encountered1h after the surgery，and50%and38%animals showed different degrees of locomotor recovery and corresponding remaining nerve fibers with many scars and cavities8wk following the surgery in Groups A and B.As for Groups C and D animals，a better appearance of the cord without much edema and ectropion was observed at1h and no locomotor recovery could be revealed at8wk.A few neurofilament-positive regenerating，but not remaining，fibers were observed within the lesion site.Group C animals had a wider gap between the two stumps of the transected spinal cord and more cavities in the injured spinal segments than those animals in Group D.CONCLUSION The authors’innovated transecting method in Group D is easy and reliable because of its properties of the completeness of tran-section and relatively milder injury to the spinal cord.
0 引言
脊髓全横断是脊髓损伤修复研究的重要模型，但国际上目前尚无公认、统一的全横断模型，而不同的横断方法可直接影响横断的完全性、脊髓损伤的程度及修复的效果［1］ .我们探索、改良、创新并比较了4种不同的横断方法，试图建立一种简便易行、横断完全、损伤较轻的脊髓全横断模型.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠32只，体质量200～250g（第四军医大学实验动物中心提供），随机分为A，B，C和D4组，每组8只.
1.2 方法 戊巴比妥钠（50mg・kg-1 ）ip麻醉动物，纵行切开背部皮肤，钝性分离皮下和肌肉组织，咬除T9～10棘突并去除椎板至横突根部，暴露T10～11节段脊髓，纵行剪开硬脊膜后，分别以4种不同方法横断各组动物脊髓.A组:用锋利尖刀片自左向右紧贴椎管内骨壁横向切断脊髓，并沿两断端间隙反复切割;B组:将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入至腹侧椎管内骨壁，然后分别切断两侧脊髓组织，沿两断端间隙反复切割;C组:首先以特制微型引导器将一段5号丝线自右向左穿过脊髓腹侧硬膜外腔，轻牵丝线提起脊髓，以长刃显微手术剪一次性完全横行剪断脊髓，将丝线由脊髓断端间隙中拉出确认脊髓完全横断;D组:以尖刀片自脊髓左侧迅速轻划至中线处，划开软脊膜及部分脊髓组织.再在同一平面由右侧快速轻划至中线，沿这一切口以同样方法依次分层切断脊髓，最后抬起脊髓两断端，确认脊髓完全横断.各组动物均在术后1h观察脊髓外观的变化，之后逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤.所有手术和观察均在手术显微镜下完成.术后8h内im甲基强的松龙40mg，2wk内im青霉素（16万U・d-1 ）并po呋喃坦啶水溶液（500g・L-1 ），每日早晚2次按摩膀胱排尿，隔日悬吊鼠尾以减轻截瘫后肢的受压、水肿及皮肤擦伤.于术后8wk观察、记录动物于平面场地上的爬行，以一种新的用Basso，Beattie和Bresnahan三人姓氏首写字母命名的BBB体系［2］ 评估后肢运动功能的变化.小于4分为无运动功能恢复，正常运动 功能则为21分.较其他既往常用的评估方法，这一体系可更为敏感地反映脊髓损伤后后肢运动功能恢复的轻微变化.运动功能评估后立即过量麻醉处死动物，40g・L-1 多聚甲醛常规灌注固定，取脊髓损伤区多个节段，连续矢状冰冻切片（厚14μm）.小鼠抗神经丝抗体（Sigma公司，1∶2000）免疫组化染色，Olympus BX60显微镜下观察.
A组脊髓明显肿胀，切口不整、外翻，断端间隙较大，对合差;B组动物脊髓轻微肿胀，背侧切口不整、外翻，两断端间隙较小，对合尚可;C组脊髓无明显肿胀，切口最为平整、边缘无外翻，对合良好，但断端间隙较大（1.5～2.0mm）;D组脊髓无明显肿胀，切口较整齐、断端间隙小（&<1.0mm），对合最佳.
2.1 肢运动功能 截瘫后A组编号为1，2，4和7的4只动物有运动功能恢复，BBB评分为5，11，8和6，其余4只BBB评分&<4，无运动功能恢复.B组3只动物（编号为3，5和7）后肢出现不同程度的自发性运动功能恢复，BBB评分为5，7和10，另5只动物仅有后肢关节轻微反射运动，BBB评分&<4，无运动功能恢复.C，D两组动物均无运动功能恢复，BBB评分&<4（Tab1）.
表1 实验鼠术后8wk BBB最高评分 略
2.2 形态学变化 4组动物脊髓损伤区正常结构遭破坏，形成范围、形态各异的瘢痕组织，两侧脊髓实质内散布大小、数量不一的空洞及点状或串珠状神经丝免疫反应溃变纤维，并与散在其间和损伤区内少量长度与生长方向不同、纤细柔软的神经丝免疫反应新生纤维形成鲜明对照.A，B组脊髓损伤区瘢痕组织不规则，A组空洞形成的严重程度甚于B组.有后肢运动功能恢复的动物，其脊髓腹侧或腹外侧均可见数量不等、成束的神经丝免疫反应纵行纤维（Fig1，2）.C，D两组损伤区横行瘢痕组织将脊髓组织完全隔断，未见神经丝免疫反应残留纤维，C组空洞形成
程度明显轻于A，B组（Fig3）.D组脊髓两断端吻合佳，瘢痕组织增生轻，空洞形成不明显（Fig4）.
图1 － 图4 略
3 讨论
我们尝试以不同方式全横断脊髓，旨在找出最大限度减小脊髓原发性及继发性损伤的最佳手术方法.A和B两组缓慢的切割方法仍对柔软的脊髓造成明显的挤压伤，使脊髓受到较大的扰动，加重了原发性和继发性损伤，尤以A组为甚.C组脊髓断端最为平整，术后短期内亦未见明显肿胀.但采用特制的微型引导器由硬膜外穿丝线时，常引起脊髓周围血管丛较多的出血，并可能对脊髓腹侧造成撞击伤.另外，以长刃显微剪一次性横行剪断脊髓时，脊髓有较为明显的挤压变形，极有可能造成脊髓更为严重的继发性损害，因为损伤区及其周围形成大量空洞和瘢痕的形态学表现，确实与术后1h肉眼观察征象极不相称.D组采用锋利刀片快速分层横断方法，术后1h观脊髓断端虽不如C组整齐，但脊髓同样无明显肿胀，且断端间隙甚小，吻合满意.镜下观察也是4组中最为满意的.由于椎管内壁粗糙不平，虽经刀片反复切割仍易造成脊髓腹侧或（和）腹外侧组织的漏切，且难以在术中获知脊髓是否被完全切断，于是A和B两组分别有50%，40%的动物出现不同程度的神经纤维残留和运动功能恢复.残留神经纤维导致运动功能恢复的原因在于神经元的自我调整和轴突出芽，促进了脊髓内局部神经环路的解剖学塑形及其与上下行通路的突触联系［3］ .C和D两组在术中足以证实横断的彻底性，无须连续切片证明.由于C组在以微型引导器穿线时易致出血及腹侧脊髓损伤，因而D组应为损伤最小的可靠方法.
尽管Tatsushi等发现锐利的切割可减轻新生大鼠的延髓水肿，并使切断的锥体束纤维获得满意再生.本实验虽明显减轻了D组成年大鼠的脊髓损伤，却并未在再生纤维的形态和数量上取得优于其他组的结果，成年哺乳动物的再生神经纤维难以逾越损伤造成的瘢痕和空洞.因此，必须求助于其他手段诱导再生纤维通过损伤区，恢复已遭破坏的神经联系［4］ .
参考文献
［1］Tatsushi I，Saburo K，Kaoru K.Spontaneous regeneration of the pyramidal tract after transection in young rats ［J］.Neurosci Lett，1998;247:151-154.
［2］Basso DM，Beattle MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats ［J］.J Neu-rotrauma，1995;12（1）:1-21.
［3］Zhang Z，Guth L，Steward O.Mechanisms of motor recovery after subtotal spinal cord injury ［J］.Exp Neurol，1998;149:221-264.
［4］Li Y，Field PM，Raisman G.Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells ［J］.Science，1997;227:2000-2002.