作者：梁 欣，海春旭，秦绪军，张晓迪，赵康涛，刘 瑞，陈宏莉，沈学锋
【关键词】 辐射损伤
关键词: 维生素C;维生素E;辐射损伤;抗氧化;超氧化物歧化酶;丙二醛
摘 要:目的 探讨Vit.C，E对60 Coγ线照射家兔的保护作用以及剂量效应关系. 方法 中国本兔随机分为12组，每组5只.Vit.C5组iv，剂量分别为10，20，40，80和160mg・kg-1 ，Vit.E油剂ig5组，剂量分别为5，10，20，40和80mg・kg-1 .第3日进行60 Coγ线（4.5Gy）照射家兔.第5日处死、剖腹取肝脏和腹腔静脉血，分别测定超氧化物歧化酶（SOD）的催化活性和丙二醛（MDA）的含量变化. 结果 辐射动物补充Vit.C和Vit.E组的肝SOD的催化活性与阴性对照组相比明显升高（P&<0.01），Vit.E的作用更明显，呈现了一定剂量效应关系;各Vit.C组肝脏MDA的含量变化不显著（P&>0.01），但血清MDA的含量轻微下降;各Vit.E组肝脏和血清中的MDA的含量均显著降低（P&<0.01），且呈现出一定的剂量效应关系. 结论 单独使用Vit.C的抗氧化作用，有时还会加重损伤;单独使用Vit.E具有一定的SOD活性保护和MDA清除作用，存在剂量效应关系，但对外周血细胞和免疫细胞则无明显的保护作用.
Keywords:vitamin C;vitamin E;radiation injury;antioxida-tion;SOD;MDA
Abstract:AIM To study the dose-effects relationship be-tween Vit.C，Vit.E，and lipid peroxidation through the mod-el of rabbit injured by radiation.METHODS Chinese rab-bits were chosen as the experimental animals and were ran-domly pided into twelve groups which each contained five.They were negative control group，positive group，and ten trial groups of Vit.C，Vit.E.The trial groups contained five different dosage of Vit.C and five different dosage of Vit.E.Peanut oil was selected as diluent which had been getting rid of Vit.E.The five groups were supplied by injection of vein with the dosages of Vit.C10，20，40，80and160mg・kg-1 every day respectively.The five Vit.E groups were supplied by gavages with the dosage of Vit.E5，10，20，40and80mg・kg-1 ，every day espectively too.On the third day all groups，except negative control group，were radiated by60 Coγray with the dose of4.5Gy.Then they were fed as before，and on the sixth day all rabbits were sacrificed.Their blood and livers were removed for the analysis of changes of catalytic activity of SOD and content of MDA.RESULTS After the radiation，the catalytic activities of hepatic SOD in the radiation groups were higher than those in the negative control group（P&<0.01），and the trial groups of Vit.C and Vit.E showed some protective effects on rabbit against radia-tion，and there was a dose-effect relationship between the Vit.E and radiation injury.The content of hepatic MDA in Vit.C group was higher than positive group except Vit.C80mg・kg-1 group（P&<0.01）.Vit.C showed some protective effects against the increase of MDA.The markable inhibition of Vit.E on hepatic and serum MDA emerged（P&<0.01），and these showed the dose-effect relationship between the dosage of vit.E and protection against injury of irradiation.CONCLUSION Vit.C is limited in antioxidation，sometimes can enhance injury;Vit.E is effective against free radical in-jury;Vit.E has protective action on SOD catalytic activity and inhibition on MDA，which shows dose-effect relation-ship.Vit.E cannot protect against radiation of peripheral blood and immunological cells.
0 引言
放射线对细胞生物化学损伤的主要机制是:电离辐射击中靶分子，靶分子发生电离与激发产生自由基，从而导致细胞生物膜、DNA大分子、蛋白质以及一系列小分子的糖脂损伤，最终导致多种自由基对细胞的功能和结构损伤［1］ .Vit.E和Vit.C都是机体的抗氧化剂.在抗氧化过程中，通过拮抗坏血酸自由基和其他产物如过氧化氢、活性氧等协同Vit.E的还原作用.目前，Vit.E的抗氧化作用是医学领域的热点问题，Vit.C和Vit.E对辐射引起的生物学损伤的相互协同作用还鲜有报道，我们以家兔为实验对象，采用4.5Gy的60 Coγ线进行照射，通过测定超氧化物歧化酶（SOD）催化活性和过氧化损伤产物丙二醛（MDA）含量变化，探讨Vit.C和Vit.E对电离辐射损伤的保护作用及剂量效应关系.
1 材料和方法
1.1 材料 970CRT型荧光分光光度计（上海分析仪器总厂），722光栅分光光度计（山东高密仪器厂）.磷钨酸（AR上海化学试剂公司）配成100g・L-1 的水溶液，硫代巴比妥钠（AR上海试剂二厂）与1∶1的冰醋酸配成6.7g・L-1 的溶液，正丁醇（AR天津泰兴试剂厂）用水饱和，Triton X-100（上海试剂有限公司）配成3mL・L-1 的水溶液，氯化硝基四氮唑蓝（上海前进农场试剂厂）配成0.98mmol・L-1 的水溶液，盐酸羟胺（天津化学试剂厂）配成6mmol・L-1 的水溶液，Vit.C针剂（1g.2.5mL-1 陕西西安制药厂产品），Vit.E（Sigma产品），食用花生油（青岛嘉里植物油有限公司产品）经脱除Vit.E处理.Vit.C溶液分别用生理盐水配制25，50，100和200mL・L-1 的溶液，Vit.E溶液分别用脱除Vit.E的花生油配制成5，10，20，40和80g・L-1 的溶液.食用花生油脱出Vit.E的处理:取2500mL食用花生油，在分液漏斗中，加等容积的无水乙醇与油充分混合、萃取5min后静置，收集下层油液，如此重复操作3次后，油中Vit.E基本除去，然后在260℃条件下加热120min，除去油中残余乙醇及Vit.E，冷却后作为配置Vit.E的溶液，ig量按每kg体质量ig1mL.实验动物:健康家兔60只（一级动物），雄性24只，雌性36只;体质量1.4～2.1kg，兔龄3mo（由第四军医大学实验动物中心提供）.
1.2 方法 将上述家兔按体质量和性别均衡随机分为12组，每组5只.阴性对照组和阳性对照组，均分别iv生理盐水1mg・kg-1 和ig处理过的花生油1mg・kg-1 ，作为对照条件.Vit.C实验组:iv Vit.C的剂量分别为10，20，40，80和160mg・kg-1 ，同时ig处理过花生油1mg・kg-1 .Vit.E组实验组:ig给予Vit.E的剂量分别为5，10，20，40和80mg・kg-1 ，同时iv生理盐水1mg・kg-1 .每组雌雄分开喂养，自由摄食，饮水;喂养第3日阳性组及各 Vit.C和Vit.E组给予剂量为4.5Gy的60 Coγ线全身照射.处理前12h停喂饲料，不停水.照射后继续给药至第5日后，乙醚麻醉家兔，剖腹取肝脏和腹腔静脉血，肝素抗凝后检测SOD的催化活性和MDA含量的变化.
1.2.1 肝脏SOD催化活性测定 肝脏加入生理盐水（2.0mL・g-1 ），用电动玻璃匀浆器匀浆（1000r・min-1 ），研杵上下移动10次，离心（1000r・min-1 ）后，取样品上清液30μL，加入75mmol・L-1 的Na2 CO3 /NaHCO3 缓冲液2mL和3mol・L-1 的Tri-ton X-1000.1mL;混匀后再加入0.98mmol・L-1 的NBT0.1mL和6mmol・L-1 的Nh3 OHHCL;经过10min的37℃的水浴震荡后，加入2mL甲酸混匀，然后用722光栅分光光度计测出其A值.
1.2.2 荧光分光光度法测MDA 取样品上清液50μL后，加入0.04mol・L-1 的h3 SO4 4mL和100g・L-1 磷钨酸500μL并摇匀，2000r・min-1 离心5min后弃上清，再加入0.04mol・L-1 的h3 SO 4 2mL和100g・L-1 磷钨酸300μL，同上法摇匀并离心，弃上清后加双蒸水1mL和6.7g・L-1 TBA1mL并摇匀，100℃水浴煮沸1h，冷却后加入水饱和正丁醇4mL并震荡抽提1min后离心，然后用荧光分光光度计测上清的A值.
2.1 肝脏SOD的催化活性的变化 家兔经过4.5Gy的60 Coγ线照射后，Vit.C实验组中各组SOD值均低于阳性对照组，高于阴性对照组，除20mg・kg-1 剂量组外，和阴性对照组比较均明显增高（P&<0.01），在40和160mg・kg-1 组，SOD催化活性上升后呈现一近似水平直线（Fig1）;在Vit.E各组，与阳性对照组比较有明显差别（P&<0.01），与阴性对照组差别不大，且随给药剂量的增加有下降趋势（Fig2）.
图1 － 图4 略
图5 － 图6 略
3 讨论
很多研究报告表明，单一或少数自由基清除剂如Vit.C和Vit.E等不能有效阻断这种链式反应，有些外源性抗氧化剂如SOD，GSH等不能进入细胞内，很难发挥有效的清除作用［2］ .大量文献报道，使用Vit.C或Vit.E对生物机体的氧化损伤都有明显的保护作用［3］ .本实验中，我们选择了低于半数致死量的4.5Gy的照射剂量，对家兔进行全身照射，目的只是造成其机体的损伤而不致死.从实验结果看，所选用的剂量范围是适宜的:照射引起了家兔机体的损伤而无致死.Vit.C组中，除血清MDA的变化表明其有一定的保护作用外，肝脏中无论是SOD催化活性还是MDA含量的变化，都未发现其有明显保护作用，也无明显剂量效应关系.说明单独使用Vit.C对辐射损伤的保护作用不明显.单独使用时，在Vit.C40mg・kg-1 剂量点还有刺激肝和血清过氧化损伤作用.Vit.E对SOD催化活性和过氧化损伤都表现出明显的保护作用，且随着给药量的增加，过氧化损伤的主要指标MDA含量下降就愈加明显.上述结果说明，①单独使用一种抗氧化剂尤其是单独使用Vit.C时，其抗氧化损伤的保护作用非常有限;②单独使用Vit.E对SOD催化活性有保护作用，能够有效抑制和清除MDA，并有剂量效应关系;③综合本实验的其他结果，在所选剂量范围内，单独使用Vit.E能够抑制和清除过氧化损伤，但对外周血细胞和免疫细胞则无明显的保护作用.原因是电离辐射损伤诱发的自由基反应，是链式连锁放大多态性的损伤反应，单一抗氧化剂整体效应肯定存在很大的局限性.
由于抗氧化剂的不同活性，不同存在形式，作用位点，包括其相对分子质量的大小和脂/水溶解性质的不同［4-6］ ，这些都决定了抗氧化剂或自由基清除剂之间相互协同和增强作用效果.因此，利用抗氧化剂复合链理论研究Vit.C和Vit.E的协同抗辐射作用，有效抑制自由基损伤，明确剂量效应关系，对于进一步探讨抗辐射损伤研究，具有重要意义.
参考文献
［1］Hai CX.Investigation of Synergistic action of antioxidants and the traditional Chinese medicine ［A］.In:National foundiation committee CSTA Life Science and Biotechnology ［M］.Beijing: Publishing Co.of CSTA，1998:324-327.
［2］Qian PP，Cheng SQ，Guo JS，Niu Yan.Effect of vitamin C and vitamin E on unenzymic Glycation and peroxidate action in rat with diabetes ［J］.Med Res，2000;29（4）:226-228.
［3］Eberlein-Konig B，Fesq H，Abeck D，Przybilla B，Placzek M，Ring J.Systemic vitamin C and vitamin E do not prevent photo-provocation test reactions in polymorphous light eruption ［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2000;16（2）:50-52.
［4］Umegaki K，Sano M，Suzuki K，Tomita I，Esashi T.Increases in4-hydroxynonenal and hexanal in bone marrow of rats sub-jected to total body X-ray irradiation:Association with antioxi-dant vitamins ［J］.Bone Marrow Transplant，1999;23（2）:173-178.
［5］Dreher F，Gabard B，Schwindt DA，Maibach HI.Topical mela-tonin in combination with vitamins E and C protects skin from ultraviolet-induced erythema:A human study in vivo ［J］.Br J Dermatol，1998;139（2）:332-339.
［6］Eberlein KB，Placzek M，Przybilla B.Protective effect against sunburn of combined systemic ascorbic acid（vitamin C）and d-alpha-tocopherol（vitamin E）［J］.J Am Acad Dermatol，1998;38（1）:45-48.