关于成骨细胞异体移植的免疫学初探

作者：郭刚　王臻　彭磊　韩天宇

【关键词】 成骨细胞
　　关键词: 成骨细胞;移植;免疫反应
　　
　　摘 要:目的 对不同种系成骨细胞植入后体液免疫及细胞免疫水平进行检测，探讨组织工程骨组织植入体内后可能的免疫排斥机制，并为应用于工程骨的种子细胞寻找可靠的种系来源. 方法 行成骨细胞同胎、同种异系、异种及自体腹直肌袋内移植，分别于术后1，2，4和8wk行免疫学及组织形态学检测. 结果 各组动物在移植后1～2wk内均可检测到特异性抗体，异种移植组持续时间最久，而同种异系及异种组在移植后2wk检测到细胞介导的细胞毒反应，4wk达高峰，异种组指标高于同种异系组. 结论 自体、同胎及同种异系细胞均可作为组织工程骨移植可靠的细胞来源，而异种细胞需进行一定的处理才可应用于工程组织的构建.
　　
　　Keywords:osteoblast;transplantation;immunological reac-tion
　　
　　Abstract:AIM To detect the cellular immunity and hu-moral immunity of different stirps osteoblast transplantation，and to discuss the potential immunological mechanism and find the reliabal cell source of tissue-engineered-bone.METHODS The osteoblasts of the same venter，allostrip，heterogeneity and autogeneity were transplanted into the rec-tus abdominus muscle of each rabbit.Immunological tests and histological observation were performed1，2，4and8week following transplantation.RESULTS A specifc anti-body reaction was detected in all groups one to two weeks af-ter transplantation，and in heterogeneity group persisted the longest time.A cell mediated cytotoxicity was detected in al-lostrip and heterogeneity groups two weeks after transplanta-tion，and reached the peak value four weeks later，the value of heterogeneity group was higher than that of allostrip group.CONCLUSION The same venter，autogeneity and allostrip osteoblasts can be the reliable cell source for tissue-engineering bone.Heterogeneity cells need to be processed before they are used in tissue-engineering.
　　
　　0 引言
　　
　　将组织工程肌肉、皮肤及软骨等组织应用于临床实验的有报道［1］ .同时骨及软骨细胞移植在替代治疗及基因治疗中的作用也得到广泛重视［2，3］ .我们通过成骨细胞异体移植诱导的体液及细胞免疫水平进行检测，从移植生理学及种系的角度探讨骨细胞移植及组织工程骨种子细胞的可靠来源，进一步确定骨细胞及组织工程骨移植的临床应用价值及适用范围.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 ①兔成骨细胞原代培养.取材于5wk大耳白兔胫骨骨膜，剪碎后分别用2.5g・L-1 胰蛋白酶30min及2.5g・L-1 II型胶原酶1h消化后，用含150mL・L-1 新生牛血清的M-199（青霉素/链霉素10万U・L-1 ，谷氨酰胺300g・L-1 ）在37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱内培养14d长满单层，胰酶消化传代至第6代，光镜下观察到钙结节，碱性磷酸酶染色进行细胞鉴定.②SD大鼠成骨细胞原代培养［6］ .取材于出生后3d SD大鼠颅骨，剪碎后用500mg・L-1 胰酶及1000mg・L-1 II型胶原酶混合消化液孵育1h后，用同上培养液37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱内培养7d长满单层，胰酶消化传代至第4代，光镜下观察到钙结节，碱性磷酸酶染色法进行细胞鉴定.
　　
　　1.2 方法 大耳白家兔40只（其中同胎12只），青紫蓝家兔12只，雌雄不限，体质量1.5～2.5kg.青紫蓝12只为同种异系组（B），同胎大耳白兔为同胎移植组（A），另取12只大耳白兔为异种移植组（C），12只为自体移植组（D），4只为正常对照组（E）.2.5g・L-1 胰酶消化培养细胞成悬液，计数5×1010 ・L-1 .无菌切开动物腹部皮肤暴露腹直肌前鞘，无菌注射器吸取细胞悬液注入鞘下肌袋内（1mL/只），丝线标记，常规关腹.A，B组注入兔成骨细胞，C组注入SD大鼠成骨细胞，D组注入自体耳廓软骨悬液1mL.
　　
　　1.2.1 ELISA法检测血清学抗体 预实验:兔成骨细胞为阳性目标抗原，大耳白兔耳廓软骨匀浆上清为无关抗原对照，移植后1wk A，B和C组血清按1∶4，1∶16，1∶64，1∶256，1∶1024，1∶4096和1∶16384稀释后为待测血清，按ELISA检测法操作，测各孔吸光度，镜下观察阳性抗原孔出现染色颗粒而无关抗原孔无染色颗粒的最小稀释度为检测最适稀释度.抗体检测:将成骨细胞悬液（5×1010 ・L-1 ）用培养液按1∶1，1∶2，1∶4，1∶8和1∶16的梯度稀释后，接种96孔板（0.1mL/孔），培育24h，移植后1，2，4和8wk的A，B，C及D组兔血清为待测血清，正常大耳白兔血清为阴性对照，按ELISA检测方法操作，测各孔吸光度.
　　
　　1.2.2 淋巴细胞转化试验（LLT） 分别于移植后1，2，4和8wk手术取出A，B，C及D组动物脾脏各3只，正常对照1只，分离出淋巴细胞，每一样本接种8孔（1×106 个/孔），其中5孔加4g・L-1 植物血凝素（PHA）0.1mL/孔，另3孔加无血清M-199液0.1mL/孔为对照.37℃，50mL・L-1 CO2 条件下培养56h，掺入3 H-胸腺嘧啶（18.5MBq/孔）培养8h，收集细胞后计数出每分钟闪烁值（cpm），淋巴细胞刺激指数=刺激组cpm/对照组cpm.
　　
　　1.2.3 淋巴细胞细胞毒试验（CMC） 96孔板接种成骨细胞（2×105 /孔）为靶细胞，每一样本18孔，孵育24h后弃培养液.淋巴细胞转化试验中分离的淋巴细胞悬液为效应细胞，将每一样本的淋巴细胞悬液0.1mL按100∶1，80∶1，60∶1，40∶1和20∶1的效靶比接种于相应个孔，每稀释梯度3孔，另留3孔不加淋巴细胞为无杀伤对照，设5孔只加淋巴细胞的阴性对照孔，每一稀释梯度加一孔（0.1mL/孔），培养4h后用完全M-199液冲洗各孔3次，每孔加入0.1mL完全培养液和10μL5μg・L-1 的MTT染液继续培养3h，PBS洗2遍，每孔加入DMSO原液0.1mL/孔片刻，492nm波长酶联吸光光度仪测A值.杀伤活性（%）=（实验孔A-阴性对照A）/无杀伤对照A×100.
　　1.2.4 组织学检查 注射部位腹直肌组块经固定、脱钙、石蜡包埋，在组块断面连续3～5张切片，HE染色，光镜下观察.
　　统计学处理:采用SPSS统计学软件包对各项检测计量结果进行配对t检验及完全随机方差分析.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 血清抗体检测 术后各组在不同时间点可检测到抗体，阳性抗体组的吸光度与自体移植组差异显著，且其随着抗原浓度的降低而减少，说明抗体是针对成骨细胞的特异性抗体（Tab1）.统计学分析表明:①同组不同抗原稀释度的A值随稀释度的减小而升高;②不同组抗体出现时间不同，A组于术后2wk出现，4wk消退;B组于术后4wk出现，8wk消退;C组于术后2wk出现，4wk达峰值，8wk起缓慢消退.③不同组不同时间点间行配对T检验表明:异种移植组相对吸光度最高，与其他组差异显著，而同种异系组与同胎组没有显著性差异.
　　
　　表1 ELISA法测定血清抗体的相对吸光度　略
　　
　　2.2 淋巴细胞刺激试验 PHA对自体移植组淋巴细胞增值影响不大，刺激指数保持在1.5～1.8之间;同胎移植组刺激指数在各时间点与自体移植组无显著性差异，而另两组与之差异显著（P&<0.05）;同种异系组淋巴细胞刺激指数于术后2wk开始升高，但与自体移植组无显著差异，至4wk达峰值，至8wk缓慢消退;异种组刺激指数的变化趋势于同种异系组相似，但自第2周起刺激指数已显著高于同种异系组（P&<0.05，Fig1）. 　　2.3 MTT淋巴细胞毒试验（CMC） CMC是淋巴细胞中产生的针对移植抗原的特异性效应T淋巴细胞，当它与带有相应抗原的靶细胞混合培养时可直接杀伤靶细胞.本结果以淋巴细胞杀伤活性为指标，自体移植组与同胎移植组的杀伤活性始终保持在5.0%～7.5%，两者间无显著性差异;同种异系组及异种组的杀伤活性与术后2wk开始与对照组产生显著差异（P&<0.01），至术后4wk达峰值，术后8wk时开始缓慢消退，但与对照组仍有显著差异（P&<0.05）;异种组淋巴细胞杀伤活性于术后2wk起显著高于同种异系组（P&<0.05），至术后8wk不变（Fig2）.
　　
　　图1 － 图2　略
　　
　　2.4 形态学检查 术后各处理组均未见明显全身及局部排斥反应，B和C组各一只动物切口缝线脱落，系手术操作所至.术后1wk，各组移植了细胞的腹直肌间隙内均可见少量圆形及多核巨噬细胞浸润，组织中可见中量梭型细胞，嗜碱性，体积较大，怀疑为移植的成骨细胞;术后2wk，自体移植组、同胎移植组及同种异系组腹直肌内炎性细胞浸润情况与术后1wk无明显变化，而异种移植组组织切片内可见大量成片炎性浸润灶，以圆形及多核巨细胞为主，未见可疑大梭型细胞;术后4wk，A，B和D组炎性细胞浸润仍无显著变化，仍可见可疑成骨细胞，而异种组炎性细胞浸润较前减退，未见可疑成骨细胞;术后8wk，各组情况同前，但同种异系组及异种组内未见可疑成骨细胞，各组均未观察到明显异位成骨现象.
　　3 讨论
　　
　　组织工程学的蓬勃发展为当前骨移植术的应用提供了新的供骨来源［5］ .我们的研究表明，同胎移植组与自体移植组的淋巴细胞刺激指数及杀伤活性均无显著性差异，组织切片见轻度炎性细胞浸润，以圆形淋巴细胞为主，在我们的试验中检测到特异性淋巴细胞介导的细胞毒作用（CMC），这说明异体移植物在激活抗体介导的细胞毒作用的同时，也有效应淋巴细胞介导的细胞毒作用的参与，组织切片中观察到较明显的圆形及多核巨细胞浸润，这与其他研究结果相符.我们的研究表明，异种移植的体液免疫及细胞免疫反应在持续时间和强度上均高于同种异系移植，组织学结果也支持这一点.但单纯的成骨细胞移植所引发的排斥反应明显低于异种骨移植的情况，这是由于异种骨组织中含有大量带有II类MHC的细胞（骨髓基质细胞、树突状细胞等）.我们只对成骨细胞移植免疫进行了初步检测，没有对成骨细胞移植后的异体内存活情况进行检测;工程骨的免疫原性与成骨细胞悬液是否存在差异有待进一步试验证实.
　　
　　我们的研究表明，应用组织工程方法制备人造骨组织并应用于临床的设想从移植免疫学角度是可行的，而同胎、同种异系成骨细胞均可作为工程骨的可靠来源，而我们对异种细胞进行微囊化处理或应用单克隆抗T细胞抗体后，仍可以应用于工程骨的制备;有人认为，大段骨缺损及由于治疗不当引起的骨折不愈合，是由于具有成骨活性的成骨细胞缺乏所至，因此向病变部位移植成骨细胞就成为骨缺损替代治疗的关键之一，自体、同胎及同种异体成骨细胞库的建立将是一个有意义的构想.近年免疫耐受的研究也提示［6，7］ ，成骨细胞可用来诱导免疫耐受以降低异种骨移植的排斥反应.
　　参考文献:
　　
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