作者：张素珍 黄培春 徐永 陈锦 蔡康荣
【关键词】 鼻咽肿瘤
关键词: 鼻咽肿瘤;端粒酶;正义寡核苷酸;细胞周期
摘 要:目的 探讨端粒酶正义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长的作用. 方法 脂质体介导端粒酶正义、反义及无义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期. 结果 端粒酶正义寡核苷酸与反义寡核苷酸一样可抑制鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞的生长，且呈剂量和时间依赖性.1.5μmol・L-1 正义寡核苷酸与CNE1细胞共培养6，12，24和48h时抑制率分别为16.3%，15.6%，20.2%和26.3%，浓度为4.5μmol・L-1 时抑制率分别为22.5%，21.5%，32.4%和39.9%;在CNE2Z细胞，浓度为1.5μmol・L-1 时抑制率分别为7.7%，25.2%，27.0%和28.8%，浓度为4.5μmol・L-1 时抑制率分别为18.1%，30.1%，32.8%和32.9%;同时流式细胞仪检测到凋亡峰，含量分别为25.3%和19.3%.无义寡核苷酸无此作用. 结论 端粒酶正义寡核苷酸可抑制鼻咽癌细胞的生长.
Keywords:nasopharyngeal neoplasms;telomerase;sense oligodeoxynucleotides;cell cycle
Abstract:AIM To investigate the effects of telomerase sense oligodeoxynucleotide on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells.METHODS Telomerase sense oligodeoxy-nucleotide（SODN），antisense oligodeoxynucleotide（A-SODN）and nonsense oligodeoxynucleotide（NODN）were introduced into nasopharyngeal carcinoma CNE1and CNE2Z cells by using lipofectin mediation，the proliferation of cells was measured by MTT method，and cell cycle were measured with flow cytometer（FCM）.RESULTS SODN inhibited the growth of CNE1and CNE2Z cells as well as ASODN，and presented dose-and time-dependent manner.After being treated with1.5μmol・L-1 SODN for6，12，24and48h，the inhibition rates were16.3%，15.6%，20.2%and26.3%respectively in CNE1cells，and7.7%，25.2%，27.0%and28.8%respectively in CNE2Z cells;with4.5μmol・L-1 SODN，the inhibition rates were22.5%，21.5%，32.4%and39.9%in CNE1cells，and18.1%，30.0%，32.8%and32.9%in CNE2Z cells.Meanwhile，the apoptotic peaks were detected with FCM and the quantity were25.3%and19.3%respectively.NODN had no inhibitory effect on CNE1and CNE2Z cells.CONCLUSION The telomerase SODN could inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma cells.
0 引言
端粒是位于染色体末端的特殊DNA重复序列，其长度的维持除端粒酶激活途径外，还有其他非酶途径，但具体情况还不清楚［1-4］ .端粒酶RNA是合成端粒的模板，因此，针对端粒酶RNA（telomerase RNA，hTR）模板区的端粒酶正义寡核苷酸可以和端粒DNA互补结合.这种结合是否能影响端粒长度的维持，从而影响肿瘤细胞的生长，是一个有意义的问题.我们通过应用端粒酶正义寡核苷酸作用于鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞，观察鼻咽癌细胞的生长状况，来探讨端粒酶正义寡核苷酸对肿瘤细胞生长的影响，为肿瘤防治提供新思路.
1 材料和方法
1.1 材料 高分化鼻咽癌细胞株CNE1和低分化鼻咽癌细胞株CNE2Z为本室提供，常规培养于含100mL・L-1 新生小牛血清的RPMI1640培养液中，实验用对数生长期细胞.端粒酶正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotide，SODN）、反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）及无义寡核苷酸（nonsense oligodeoxynucleotide，NODN）由上海博彩生物技术公司合成，全硫代修饰;SODN序列:5’-CTA ACC CTA AC-3’，与hTR模板区合成端粒的11个碱基序列（46～56）完全相同，ASODN序列:5’-GTT AGG GTT AG-3’，互补于hTR模板区合成端粒的11个碱基序列（46～56）.
1.2 方法 寡核苷酸的脂质体包裹转染及分组:寡核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）分别溶于不含血清及抗生素的RPMI1640培养液中，加入同样方法稀释的阳离子脂质体lipofectin（Gibco）液中，二者混匀，室温放置10～15min，使之形成脂质体-ODN复合物，用于转染.转染前，用无血清无抗生素培养液漂洗细胞1次，分为SODN，ASODN，NODN，脂质体和空白对照组.分别加入终浓度为1.5，3.0，4.5和6.0μmol・L
-1 的SODN及终浓度为4.5μmol・L-1 的ASODN和NODN，脂质体组加入只含脂质体的无血清无抗生素培养液，空白对照组加入相同量的无血清无抗菌素培养液.培养24h时，再加入1/3初始剂量的SODN，ASODN，NODN，脂质体培养液及空白培养液.细胞增殖能力检测采用MTT法:对数生长期细胞接种于96孔培养板，细胞密度为2.5×107 ・L-1 ，每孔0.2mL.在ODN与细胞共培养6，12，24和48h时加MTT（5g・L-1 ）10μL，继续培养4h，吸出培养液，加DMSO100μL・孔-1 ，全自动酶标仪测定波长570～630nm的A值.每组设4个复孔，实验重复3次，计算各组均值.并计算生长抑制率［（未处理组A值-处理组A值）/未处理组A值×100%］.细胞周期分析采用流式细胞仪检测:终浓度为4.5μmol・L-1 的SODN，ASODN和NODN与细胞共培养48h后，收集细胞，750mL・L-1 乙醇固定，检测前离心去乙醇，加入50mg・L-1 PI（碘化丙锭）0.5mL，4℃避光30min，上机检测.
统计学处理:实验数据以x ±s表示，显著性差异采用t检验.
2 结果
2.1 SODN对CNE1和CNE2Z细胞增殖的影响 SODN对CNE1和CNE2Z细胞生长表现明显的抑制作用，并呈浓度、时间依赖性.浓度为1.5μmol・L-1 时，在CNE1细胞培养24h开始出现抑制作用，在CNE2Z细胞，培养12h时即出现抑制作用（Tab1），且抑制率随浓度的增加和时间的延长而增强.A-SODN对CNE1和CNE2Z细胞的生长也表现明显的抑制作用，并随时间延长抑制作用增强.NODN和脂质体处理组及空白对照组的CNE1和CNE2Z细胞生长不受影响（Tab2）.
表1 端粒酶正义寡核苷酸对CNE1和CNE2Z细胞生长的影响 略
2.2 SODN对CNE1和CNE2Z细胞周期的影响 CNE1和CNE2Z细胞用4.5μmol・L-1 SODN处理48h后，FCM检测，结果在G1 期前有凋亡峰存在，凋亡细胞分别占全部细胞的25.3%和19.3%（Fig1）.4.5μmol・L-1 ASODN作用后也检测到凋亡峰，其他组未见凋亡峰.
无限增殖是癌细胞的显著特征之一，其原因目前还不清楚.研究表明，端粒酶激活即可维持端粒长度，并赋予细胞无限增殖能力.肿瘤细胞及永生化细胞即表现如此［5，6］ .应用端粒酶反义核酸封闭端粒酶RNA，或用端粒酶逆转录酶反义核酸封闭逆转录酶的表达，可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞的生长［8-10］ .我们应用互补于端粒酶RNA模板区的反义核酸封闭端粒酶活性后，CNE1和CNE2Z细胞生长均受到抑制，说明端粒酶激活，端粒一定长度的维持在鼻咽癌细胞生长中起重要作用.但有意义的是我们首次观察到应用端粒酶正义核酸（相当于端粒反义核酸），同样可使鼻咽癌细胞的生长受到抑制，且呈剂量和时间依赖性，而无义寡核苷酸无此作用.
表2 端粒酶正义寡核苷酸对CNE1和CNE2Z细胞生长抑制率的比较 略
图1 流式细胞仪检测结果 略
端粒长度的调节除有端粒酶活性机制外，还有其他非酶机制［1-4］ .FCM测定结果提示，端粒酶正义核酸抑制肿瘤细胞生长的作用还可能与促进细胞凋亡有关.至于端粒酶正义核酸抑制肿瘤细胞生长有无广泛性及其抑制生长的机制尚需进一步研究.
参考文献
［1］Bolzan AD，Paez GL，Bianchi MS，Biamchi NO.Analysis of telomere repeats and telomerase activity in human colon carcino-ma cells with gene amplification ［J］.Cancer Genet Cytogenet，2000;120（2）:166-170.
［2］Fmngori E，Hirayama R，Nakamma KI.Telomere shortening in gastric carcinoma with aging despjite telomerase activation ［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2000;126（8）:481-485.
［3］Raymond E，Soria JC，Izbicka E，Boussin F，Hurley L，Von-Hoff DD.DNA G-quadruplexes telomere-specific proteins and telomere-associated enzymes as potential targets for mew an-tioancer drugs ［J］.Invest New Drugs，2000;18（2）:123-137.
［4］Cockell MM，Perrod S，Gasser SM.Analysis of Sir2pdomains required for rDNA and telomeric silencing in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Genetics，2000;154（3）:1069-1083.
［5］Zhang FX，Zhang XY，Fan DM，Yan Y，Xu ZK.Telomerase activity in gastric cancer and precancerosis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（4）:457-459.
［6］Shi M，Su MQ，Yang XZ，Ma HX，Zhang GM.Defection of ac-tivity of telomerase in cervical carcinoma tissues ［J］.Di-si Jun-yi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（14）:1321-1323.
［7］Kivozuka Y，Yamamoto D，Yang J，Uemura Y，Senzaki H，Adachi S，Tsubura A.Correlation of chemosensitivity to antix-ancer drugs and telomere length，telomerase activity and telom-erase RNA expression in human ovarian cancer cells ［J］.Anti-cancer Res，2000;20（1A）:203-212.
［8］Du H，Xin XY，Wang J.Attenuation of telomerase activity by an antisense oligonucleotide against hTERT mRNA in ovarian cancer cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:366-368.
［9］Liu L，Sun BZ，Zhang CS，Zhang HZ，Yan Y，Zhang FX.The effect of telomerase antisense RNA on HL-60［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:518-520.
［10］Zhang CS，Wang WL，Huang GS，Liu LI，Hu PZ，Ma FC，Zhu XH.Effects of antisense telomerase RNA on SMMC7721［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（18）:1637-1640.