作者：徐磊 赵晏 黄玲 薛荣亮 王会生
【关键词】 谷氨酸
关键词: 谷氨酸;兴奋毒性;基因，fos;视网膜;小鼠
摘 要:目的 观察谷氨酸对小鼠视网膜神经细胞c-fos表达的变化，探讨谷氨酸的神经毒性作用. 方法 昆明系小鼠妊娠晚期经口一次性大剂量谷氨酸钠ig（4.0g・kg-1 ），仔鼠于出生后10，20和30d取眼球，多聚甲醛固定，恒冷切片，应用免疫组织化学方法对视网膜神经细胞c-fos的表达进行了观测. 结果 10，20和30日龄谷氨酸组小鼠视网膜神经细胞c-fos表达阳性神经元分别为1474，1250及859cells・mm-2 ，比正常小鼠c-fos的表达明显增高（1474vs744cells・mm-2 ，P&<0.05;1250vs538cells・mm-2 ，P&<0.05;859vs404cells・mm-2 ，P&<0.05）. 结论 外源性谷氨酸作用于成长发育中仔鼠的视网膜神经细胞，并引起细胞内c-fos过度表达，可能诱导视网膜神经细胞凋亡.
Keywords:glutamates;excitotoxicity;genes，fos;retina;mice
Abstract:AIM To observe the toxic effect of monosodium glutamate on the expression of c-fos in the retinal neurons in
mice.METHODS Kunming mice were given4.0g・kg-1 monosodium glutamate via oral administration at the late stage of pregnancy.The eyeballs of filial mice were removed on the postnatal days of10，20and30，the specimens then fixed with paraformaldehyde and sectioned into pathological slices by the Cryocut.Immunohistochemistry was used to de-tect the expression of c-fos in retinal neurons.RESULTS In the monosodium glutamate-treated mice，there were1474cells・mm-2 positive immunoreactive neurons of c-fos on postnatal day10，1250cells・mm-2 on postnatal day20，859cells・mm-2 on postnatal day30while there were respective-ly744，538，404cells・mm-2 in the normal mice retinas（1474vs744cells・mm-2 ，P&<0.05;1250vs538cells・mm-2 ，P&<0.05;859vs404cells・mm-2 ，P&<0.05）.CONCLUSION Exogenous monosodium glutamate has the effects on the developing retinal neurons that it can produce an overexprssion of c-fos in the retinal cells，corresponding with induction of neuronal apoptosis.
0 引言
谷氨酸作为内源性兴奋性神经递质参与机体的许多生理活动，并在学习和记忆、神经系统发育过程中突触的可塑性、神经元的生长、神经元突起的生长和退化中起重要作用［1，2］ .外源性谷氨酸被证实可以通过血-胎盘屏障而作用于中枢神经系统［3］ ，导致胚胎下丘脑毁损等
［4］ .c-fos基因的诱导和表达是反映神经通路的一种新方法，已被应用于痛觉感受及其调控的研究［5，6］ ，c-fos持续过度表达与细胞凋亡有关.为了观测外源性谷氨酸对新生小鼠眼视网膜神经细胞的兴奋毒性作用，我们应用免疫组织化学方法观察c-fos在谷氨酸损伤小鼠视网膜神经细胞中的表达.
1 材料和方法
1.1 材料 L-谷氨酸单钠购自浙江湖州生物化学制品厂.在母鼠妊娠的18～21d经口给于一次性谷氨酸溶液ig（4g・kg-1 ）.昆明系小鼠购自西安交通大学实验动物中心.小鼠喂以标准饲料和饮用自来水，环境温度为（23±1）℃.胚胎1d确定为小鼠交配后24h，小鼠怀孕以出现阴栓为凭.母鼠产仔后20d与仔鼠分置.仔鼠10，20和30d龄时苯巴比妥ip麻醉，心腔内灌注0.01mol・L-1 PBS2min，接灌注预冷的40g・L-1 多聚甲醛固定液3min.取出鼠眼后放在4℃多聚甲醛固定液中4h，再置于300g・L-1 蔗糖溶液中4℃18～28h，待其沉底，去蔗糖溶液，用组织包埋剂附着，快速冷冻，-70℃保存.
1.2 方法 10，20和30d龄（P10，P20和P30）仔鼠眼在恒冷切片机上切成12～14μm厚度的组织切片，平铺于经硅化处理的载玻片上.每块组织切片周围涂上指甲油以防止液体流脱.切片从-70℃取出后室温下干燥30～45min，PBS浸洗10min，40g・L-1 多聚甲醛30min，PBS冲洗，正常羊血清封闭10min，1∶150一抗4℃过夜（16h），生物素化二抗37℃孵育50min，链酶亲和素生物素酶复合物37℃孵育40min.每一步孵育后均用PBS冲洗，最后一次PBS冲洗后加DAB显色8～10min，组织切片呈现深棕色反应，在PBS中浸15min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.设立①不加一抗的阴性对照和②未使用谷氨酸的正常对照，其免疫组织化学步骤同上.相邻组织切片做Nissl染色以确定组织结构.Olympus光学显微镜下阅片并摄像.计数各组视网膜神经细胞阳性细胞数，应用SigmaStat2.0统计软件作方差分析.
2 结果
c-fos免疫阳性细胞在镜下胞核呈深棕色，圆形、椭圆形或是不规则形状，散在或集中分布于视网膜层中（Fig1）.在10d龄小鼠，谷氨酸组视网膜神经细胞c-fos免疫阳性细胞比对照组明显增高（1474vs744cells・mm-2 ，P&<0.05）;在20d龄小鼠，谷氨酸组视网膜神经细胞c-fos免疫阳性细胞比对照组明显增高（1250vs538cells・mm-2 ，P&<0.05）;在20d龄小鼠，谷氨酸组视网膜神经细胞c-fos免疫阳性细胞比对照组明显增高（859vs404cells・mm-2 ，P&<0.05，Tab1，Fig1）.
两组免疫阳性细胞在出生后10d达最高;随生长发育时间的增长，c-fos阳性细胞数不断减少（Tab1）.
3 讨论
谷氨酸是中枢神经系统内的主要内源性兴奋性神经递质，它可以选择性地存在于谷氨酸能神经末梢和突触囊泡，在遇到生理性刺激时从突触前膜释放， 引起突触后膜去极化.在正常情况下，谷氨酸对中枢神经细胞的功能起增强和保护作用，但过量的谷氨酸对中枢神经系统有兴奋毒性.有研究结果提出，4g・kg-1 的谷氨酸单钠sc可以引起Wistar新生鼠下丘脑弓状核神经元的选择性毁损［7］ ，并且仔鼠存活时间越长，其下丘脑弓状核神经元缺失越高.3 H-Glu示踪试验证实，2g・kg-1 的谷氨酸可以通过胎盘屏障进入胎鼠体内，较均一的分布于中枢神经系统和内脏各个器官，下丘脑弓状核及腹内侧核神经元被明显破坏，出现胞质肿胀、核固缩、神经元数目减少，仔鼠记忆能力和Y-迷宫空间分辨能力均严重受损［8］ .这与我们以前的研究结果一致，而我们应用高剂量谷氨酸单钠经口母鼠妊娠晚期ig动物模型与上述sc谷氨酸模型又有所区别，胎鼠脑组织摄取3 H-Glu的过程与母鼠的类似，但胎鼠脑组织与3 H-Glu的结合量明显高于母鼠［9］ .
表1 c-fos在小鼠眼视网膜神经细胞的表达 略
谷氨酸是视网膜神经回路中的重要神经递质.20世纪50年代末，Lucas首次报道大剂量谷氨酸钠可以造成视网膜内层细胞出现不可逆性坏死.近来有研究发现，4g・kg-1 的谷氨酸单钠sc可以引起Wis-tar新生雄性大鼠眼球重量明显减低，视网膜节细胞、内核层、内网层及外网层厚度明显变薄，神经细胞出现早期水肿、迟发型固缩死亡、细胞数量减少，其神经细胞损伤程度从新生期至成年期呈进行性加重［10］ .谷氨酸主要与视网膜神经细胞上的谷氨酸受体结合而发挥作用.
图1 小鼠视网膜细胞c-fos的表达 略
Fos蛋白是由380个氨基酸残基组成的凋亡相关蛋白，一般存在于细胞核内，免疫组织化学方法只有胞核着色.通常将Fos蛋白作为伤害性信息传递通路上各级中枢神经元被激活的一种标记而加以研究.有人应用基因扩增技术对伤害性光线引发视网膜神经元c-fos基因的调控进行了定量分析，发现光照后的15min即出现c-fos的上行调控，2h后达最高水平，20h后恢复到原有水平.体外细胞培养实验也证实，大剂量谷氨酸可以导致新生小鼠80%视网膜神经细胞破坏.成熟期的神经细胞不易受到外源性谷氨酸的破坏.在本研究中，从出生后10～30d的仔鼠，不论在正常对照鼠组还是在谷氨酸损伤鼠组，其视网膜神经细胞c-fos阳性细胞数呈进行性减低，提示随着视网膜神经细胞的进一步成熟，细胞抗凋亡能力不断增强，谷氨酸的兴奋毒性作用不断减退;其次，大量神经胶质细胞的生长对神经元的修复作用有很大提高.因此，谷氨酸作用于成长发育中仔鼠的视网膜神经细胞，引起细胞内c-fos过度表达，可能诱导视网膜神经细胞凋亡.
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