关于水蛭提取物对大鼠脑血栓后脑组织MDA，SOD和NO含量的影响

作者：杨文清　王四旺　谢艳华　王俊卿

【关键词】 光化学
　　关键词: 光化学;脑血栓;丙二醛;一氧化氮;水蛭提取物
　　
　　摘 要:目的 探讨光化学法诱导大鼠脑血栓形成中丙二醛（MDA），NO和SOD含量的变化及水蛭提取物（EFH）对其脑组织保护作用的机理. 方法 采用光化学法诱导大鼠大脑中动脉（MCA）脑血栓形成模型，观察脑缺血后及药物作用后4h，24h脑组织匀浆中MDA，SOD和NO的含量变化. 结果 大鼠脑缺血后4h时MDA的含量增高，24h明显增高;24h时EFH治疗组MDA含量明显降低，由（4.77±0.24）mol L-1 降为（2.51±0.44）mol L-1 （P&<0.05），与模型组相比24h时SOD的活性明显增高（P&<0.05）.NO含量在脑缺血后4h降低，24h时与假手术组相比明显升高（P&<0.01）. 结论 光化学诱导大鼠脑血栓形成，其脑组织的损伤与MDA及NO的神经细胞毒性作用有关，EFH可清除MDA的生成，减少SOD消耗，降低NO的毒性，对缺血脑组织有保护作用.
　　
　　Keywords:photo-chemistry;cerebral ischemia;malondialde-hyde;nitric oxide;extract from hirudo
　　
　　Abstract:AIM To observe changes in contents of malondi-aldehyde（MDA），SOD and NO during photo-chemically in-duced thrombosis in the rat’s brain，and to study mechanism of EFH in protection of its brain.METHODS On cerebral thrombus designed model photo-chemically induced at the rat’s middle cerebral artery，changes in contents of MDA，SOD and NO in brain homogenate were observed4h，24h after brain ischemia and drug action.RESULTS At4h after the rat’s brain ischemia MDA contents rose，and at24h rose significantly.At24h MDA contents in the hirudo treatment group dropped significantly from（4.77±0.24）mol L-1 to（2.51±0.44）mol L-1 （P&<0.05）.Compared with the model group at24h SOD activity significantly rose（P&<0.05）.At4h following ischemia NO contents dropped，and at24h rose significantly（P&<0.05）compared with the pseudo-operation group.CONCLUSION Brain injury resulting from photo-chemically induced cerebral thrombus in the rat is associated with neurocytotoxicity of MDA and NO.EFH blocks the production of MDA，reduces consumption of SOD，and weakens NO toxicity，thus providing protection for ischemic brain tissues.
　　
　　0 引言
　　
　　缺血性脑血管疾病是人类三大死亡原因之一，仅次于癌症及心肌梗死，对该病的防治，减少因神经系统等受损而致的后遗症是基础医学和临床医学的主要研究课题.以往谢艳华，王四旺等［1］ 已观察到水蛭提取物可增加正常及血瘀大鼠脑血流量.我们旨在此基础上采用光化学诱导的大鼠脑血栓模型，进一步探讨其光化学诱导大鼠脑血栓模型形成原理及水蛭提取物的作用机制.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 SD雄性大鼠，12wk，体质量（300±50）g，二级动物（由本校动物中心提供）;丙二醛（malon-dialdehyde，MDA），SOD，NO测试盒（均购自南京建成生物工程研究所）;WFZ800-D3A型单光束紫外/可见分光光度计（北京第二光学仪器厂）.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 实验分组 分为假手术组、模型组、水蛭提取物（EFH）组（2g kg-1 和4g kg-1 ），每组10只大鼠，用药组均在模型后30min给药，由股静脉注入.
　　
　　1.2.2 模型制备 采用光化学法文献［2］ 改进，即从左侧颞部入路，牙科钻开d=5mm的骨窗暴露大鼠大脑中动脉起始部及嗅束至大脑下静脉间的一段MCA为光照部位，光照分二步，首先股静脉注入15g L-1 （0.03g kg
-1 ）虎红B，持续光照MCA起始部10min，再经股静脉注入半量15g L-1 的虎红B.再光照嗅束至大脑下静脉间的MCA段，10min后造模型结束
　　
　　1.2.3 MDA，SOD，NO含量测定 术后及用药后4h，24h分别取脑，制备100g L-1 的脑组织匀浆，取10g L-1 脑组织匀浆，测定MDA，SOD，NO的含量，具体操作按试剂盒说明书进行.
　　
　　1.2.4 数据处理 实验数据以x ±s表示，统计处理采用SPLM软件包的χ2 分析.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 EFH对脑缺血后脑组织MDA，SOD，含量的影响 模型组MDA含量在4h时已增多，并持续上升，在24h高达假手术组3倍（P&<0.01）;SOD的含量在血栓形成的4h已低于假手术组，在24h下降至最低点（P&<0.01）;用药后MDA含量与模型组相比明显降低，其中以EFh3 （4g kg-1 ）组为显著，24h时其用药组由（4.77±0.24）mol L
-1 下降为（2.51±0.44）mol L-1 ，用药组SOD的活性与模型组相比有明显增高，尤以24h时相差非常显著（P&<0.01，Tab1）.
　　
　　表1 水蛭提取物（EFH）对脑缺血后脑组织MDA和SOD含量的影响　略　　
　　
　　2.2 EFH对脑缺血后脑组织NO含量的影响 血栓形成4h模型组，脑组织中NO含量与假手术组相比，显著降低（P&<0.05），24h时NO含量明显增高，用药组NO的含量在24h时均较模型组低（P&<0.05，Tab2）. 转贴于 　　表2 水蛭提取物（EFH）对脑缺血后脑组织NO含量的影响略
　　
　　3 讨论
　　
　　自由基又称游离基，是外层轨道具有不配对电子的原子、分子或基团，具有化学活性强、连锁反应的特点，即一种自由基的产生可引发更多的自由基的生成.已证明脑缺血、低氧都可使脑细胞膜磷脂分解，不饱和脂肪酸自氧化，使具有膜结构的血管内皮细胞，内质网，溶酶体，线粒体等结构破坏导致功能紊乱.目前认为，由于自由基所造成的脂质过氧化是缺血性脑组织损伤的重要发病机理［5］ .我们观察了脑血栓形成后不同时间MDA，SOD含量的变化，可见脑缺血后4h时MDA含量明显增高，并持续上升，说明脑血栓形成后组织的破坏呈进行性发展，与组织的MDA含量成平行关系.SOD活力下降与MDA含量增多有关，而EFH组与模型组相比各组MDA含量显著降低，SOD活性升高.
　　
　　NO是一种生理活性物质，不仅存在于外周组织调节外周血管，而且存在于脑组织中，既分布在脑血管内膜，又分布在神经细胞中，调节脑血流量，因此NO对脑血管疾病的发生发展有着十分重要的作用［6，7］ .大鼠MCA血栓形成4h，NO含量降低，我们认为主要是血管内皮细胞受损，NO分泌减少.24h时NO的含量明显增高.这种增高起初是机体的代偿反应，通过增加脑血流量，减轻脑缺血程度.但NO是一种自由基在大量生成的情况下可通过超氧化自由基起细胞毒性作用，其反应式为:NO2 +O-2 →ONOO-ONOO- +H+ →ONOOH ONOOH→OH+NO-2
　　
　　这种反应不仅阻断了NO的生理功能，而且生成了活性更强的羟自由基和二氧化氮，使细胞膜发生脂质化反应.核酸及脂质膜损伤，SOD虽可催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断该自由基损伤组织和与NO2- 结合使NO2- 降解，但SOD含有疏基，疏基易被自由基氧化，而使酶失活;同时NO的大量代偿生成又促使多巴胺（DA）大量释放而导致神经元的损伤，在24h时大鼠体内MDA含量增多，SOD含量下降，歧化作用变弱.NO含量增高，对脑组织继发损伤，使脑组织水肿更加明显，脑梗塞面积增大，但NO的含量升高到什么样水平才能引起脑继发性损伤却是一个复杂的问题;用药组NO的含量在24h已明显低于模型组，我们考虑NO含量的变化主要是通过EFH清除MDA生成，减少SOD的消耗，增加SOD的催化超氧阴离子自由基的歧化反应，减少超氧阴离子自由基与NO-2 结合而促使NO2- 的降解;随着对NO生理学、病理生理学及药理学意义的不断研究，使人们更清楚地了解到NO不仅参与脑的保护作用，且在病理状态下也参与脑损伤，这对于分析脑血管疾病的生理及病理生理现象以及寻找有效药物提供新的思路.
　　参考文献:
　　
　　［1］Xie YH，Wang SW，Wan YM，Liu XZ.Effect of extract from hirudo in cerebral blood flow ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（6）:518-521.
　　［2］Watson BD，Dietrich WD，Busto R et al.Induction of repro-ducible brain infarction by photo-chemically inducted thrombosis ［J］.Ann Neurol，1985;17（5）:497-504.
　　［3］Li YK，Wang YM，Zhong Y，Yao L，Shi Y，Fang FX.Zhongyao yaoli shiyan fangfaxue（The traditional Chinese medicine pharmacological experiment methodology）［M ］.Shanghai:Shanghai Kexue Jishu Chubanshe（Shanghai Science and Technique Publishing Company），1991:78-90.
　　［4］Lu WH，Wang Q.Progress of modern research on the traditional Chinese medicine hirudo ［J］.Zhongguo Zhongyao Zazhi（J Chin Mater Med），1994;19（12）:755-795.
　　［5］Slater TF.Free radical mechanism in tissue injury ［J］.Biochem J，1984;222（1）:1-15.
　　［6］Sakashita N，Ando Y，Yonehara T.Role of superoxide dismu-tase and nitric oxide on the interaction between brain and sys-temic circulation during brain ischemia ［J］.Biochem Biphys Ac-ta，1994;1227（2）:67-73.
　　［7］Dawson VL，Dawson TM，London ED.Nitric oxide mediates glutamateneurotoxicity in primary cortical cultures ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991;92（14）:6368-6371.转贴于