【关键词】 心肌
关键词: 心肌;细胞分离
0 引言
加拿大学者Bustamante等［1］ 于1982年首次报道了人单个心房肌细胞的分离方法，以后许多外国学者采用改良的Bustamante法成功分离人单个心房肌细胞［2］ .目前国内人单个心房肌细胞分离方法尚未见报道.我们参考国外单个人心房肌细胞的分离方法，经过改良，成功地分离出100例患者的心房肌细胞，建立了适合我国人种的心房肌细胞的分离方法.本方法的建立，为直接研究我国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学特性的改变提供了物质基础，对于心房疾病（如心房纤颤）发病机制和治疗方法的研究，可以在不用动物模型的条件下，在细胞乃至分子水平直接进行.
1 材料和方法
1.1 试剂和溶液的配制2，3］ 胶原酶（日本YAKULT公司），蛋白酶XXIV（美国Sigma公司，）.无钙液（mmol L -1 ）:NaCl126，KCl5.4，MgCl2 1.0，Nah3 PO4 0.33，葡萄糖10.0，HEPES（Sigma公司）10.0，用NaOH调pH至7.4.细胞保护液（KB液，mmol L-1 ）:KCl20.0，Kh3 PO4 10.0，葡萄糖10.0，谷氨酸70.0，牛磺酸10.0，EGTA（Sigma公司）10.0，牛血清白蛋白（美国Amerco）10g L-1 ，用KOH调pH至7.4.有钙液（mmol L
-1 ）:NaCl126，KCl5.4，MgCl2 0.8，CaCl21.0，Nah3 PO4 0.33，HEPES（Sigma公司）10.0，葡萄糖5.5，用NaOH调pH至7.4.未注明试剂均为国产试剂.
1.2 标本采集 心房标本取材于行心外科手术患者的右心耳.用10mL氧饱和的无钙液在37℃保温下，于5～10min内运送到实验室.
1.3 单个人心房肌细胞的分离保存 标本在氧饱和无钙液中剪成1mm3 小块，用无钙液在37℃磁力搅拌下洗涤3次，每次4min，洗除标本中的血液和钙离子;在含有胶原酶（0.4g L-1 ）、蛋白酶（0.18g L-1 ）的无钙液中消化30～45min后，换成含有胶原酶（0.4g L-1 ）的无钙液进行第二步消化;20～30min后，将组织块在KB液中轻轻吹打，使细胞松散脱离组织块;细胞悬液用200目滤网过滤，分离出的单个人心房细胞用KB液保存.整个实验过程温度始终保持在37℃，并且在充氧、磁力搅拌（频率4Hz）条件下完成.
图1 －图4 略
1.4 复钙及显微镜观察 分离出的心房肌细胞，在KB液中保存30～60min后，吹匀，经200目滤网过滤，1000r min -1 离心5min，弃上清，加有钙液5mL吹匀后加入培养皿中，于倒置显微镜下观察.
1.5 膜片钳技术记录钾电流 应用仪器为美国AXON公司生产的Axopatch300B放大器，按
参考文献
［4］方法进行.1.6 人心房肌细胞的活性鉴定［5］ 用4g L-1 的台盼蓝1份、细胞悬液9份进行染色，3min后用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，算出活细胞百分比.
2 结果和讨论
采用两步酶消化分离法，分离出杆状、横纹清晰、细胞膜完整的具有典型特征的人心房肌细胞（图1）.经KB液保护30～60min，复钙后，显微镜下观察一些细胞有收缩，完全贴壁后收缩消失，形态无明显变化.膜片钳记录到钾电流（图2）.在有钙液中保存24h，细胞仍平滑、清洁度好、细胞膜完整（图3）.经台盼蓝染色，死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染（图4），细胞成活率为30%～70%. 转贴于 应用Langendoff装置对小鼠、大鼠、豚鼠等主动脉逆行插管灌流的方法，可以获得心肌细胞［6，7］ ，但所获得的细胞多数为心室肌细胞，很难分离出心房肌细胞.对于心房肌整体及单个细胞在生理及病理情况下生物学特性及改变的研究，以往多靠动物模型来完成［8，9］ ，但动物心脏与人的心脏在大小、质量、生理学特性及病理学改变上存在差异，所以动物模型研究的良好结果不能直接推论到人体.直接在人的心房肌细胞上进行某些疾病（如心房纤颤）发病机制及治疗方法的研究，其结果是最可靠的.1982年Bustamante等［1］ 首次报道了人单个心房肌细胞分离方法，以后许多国外学者采用改良的Bustamante方法成功分离单个人心房肌细胞.这使得直接研究人的心房肌细胞成为现实.但国内人单个心房肌细胞分离方法的报道极少见［2］ .我们采用国外学者的分离方法，摸索分离国人单个人心房肌细胞，进行了50余例，均未取得成功.以后反复试验，将胶原酶及蛋白酶的浓度调整至
参考文献
［2］分离方法的一半，并且把两步总消化时间从约90min缩短至约1h，成功地分离出100余例患者的心房肌细胞.经台盼蓝染色，细胞包膜完整，显微镜观察，细胞具有收缩功能，膜片钳试验证实了细胞的电生理活性.改良后所分离的细胞功能与国外文献报道无差异.本方法的建立，为直接研究国人心房肌细胞在生理情况下的生物学特性及病理情况下生物学特状的改变提供了物质基础.参考文献:
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